[發明專利]一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法

無效

• 申請號: 201210345248.2
• 申請日: 2012-09-18
• 公開（公告）號: CN102827822A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 周哲敏;高新星;田亞平;崔文璟;周麗;丁寧
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，本發明涉及一種以陰離子交換層析為主要手段的重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，屬于生物制品分離純化技術領域。

背景技術：

氨肽酶(aminopeptidases，簡稱APs，EC?3.4.11)是一類能夠水解蛋白質和多肽N端氨基酸的外切蛋白水解酶，廣泛存在于動植物以及微生物中。氨肽酶根據最易反應底物的不同可以分為亮氨酸氨肽酶、賴氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶等。氨肽酶在蛋白水解液脫苦和蛋白質的深度水解中有著重要作用，目前主要用于食品工業中，包括魚肉類加工工業、植物類加工工業以及以微生物為原料的加工工業等，它可以增加游離氨基酸的量，改善風味，提高營養價值，還可以作為醬油醬料等調味品的添加劑。

目前國內的氨肽酶產品生產尚屬空白，所用氨肽酶基本為國際產品，純度較高，價格也較為昂貴，而本發明旨在開發出一種從分泌表達亮氨酸氨肽酶的重組枯草芽孢桿菌發酵液中分離純化出高純度、高得率的電泳級氨肽酶的方法。

發明內容：

本發明的目的是提供一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法。

本發明的具體步驟如下：

1)將發酵液離心去除菌體，收集發酵上清液；

2)將發酵上清液經過硫酸銨分級沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后進行透析；

3)將透析后的酶液加入到用Tris-HCl緩沖液A(含50mmol/L?Tris，pH?8.5)平衡好的DEAE陰離子交換柱Hiprep?DEAE?16/10Fast?Flow中，用Tris-HCl緩沖液B(含50mmol/L?Tris，1mol/L?NaCl，pH?8.5)梯度(0-60％)洗脫4個柱體積，流速為2.5ml/min，收集各個出峰蛋白；

4)分光光度法檢測亮氨酸氨肽酶酶活，確定活性蛋白部分。

本發明所述發酵液是指：出發菌株為重組枯草芽孢桿菌(含連接了來源于枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶基因全序列的PMA5質粒，宿主菌為Bacillus?subtilis?WB600)。TB發酵培養基，發酵條件：37℃，200rpm培養32h。

所述枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶基因全序列中開放閱讀框序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明的詳細的步驟為：

(1)將重組枯草芽孢桿菌(含連接了來源于枯草芽孢桿菌Zj016氨肽酶基因全序列的PMA5質粒，宿主菌為Bacillus?subtilis?WB600)發酵，誘導表達條件為37℃，200rpm培養32h；

(2)將發酵液離心去除菌體，收集發酵上清液；

(3)硫酸銨沉淀

向發酵上清液中加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，至飽和度為60％，緩慢攪拌至其完全溶解。調節pH值，使酶液的pH保持在8.5，靜置一小時后10000×g低溫離心10min，低溫離心去除蛋白沉淀收集上清液。再向上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為70％，緩慢攪拌至其完全溶解。調節pH值，使酶液的pH保持在8.5，靜置一小時后10000×g低溫離心10min，低溫離心收集蛋白沉淀。將沉淀溶解在Tris-HCl緩沖液A(含50mmol/L?Tris，pH?8.5)中并且4℃透析數小時；

(4)DEAE離子交換層析

將透析后的酶液加入到用Tris-HCl緩沖液A(含50mmol/L?Tris，pH?8.5)平衡好的DEAE陰離子交換柱Hiprep?DEAE?16/10Fast?Flow中，用Tris-HCl緩沖液B(含50mmol/L?Tris，1mol/L?NaCl，pH?8.5)進行梯度洗脫，0-60％洗脫4個柱體積，流速為2.5ml/min，收集各個出峰蛋白；

(5)分光光度計法檢測出峰蛋白酶活

酶活測定條件：以L-亮氨酸-對硝基苯胺為底物，在50mM?pH?8.5的Tris-HCl緩沖液中加入稀釋一定倍數的酶液和底物(1mM)，50℃水浴反應10min，在405nm下測定吸光度；酶活定義：在50℃下，1min分解L-亮氨酸-對硝基苯胺產生1μM對硝基苯胺所需的酶量為一個酶活單位(1U)。

本發明的有益效果：本發明提供了一種重組亮氨酸氨肽酶的分離純化方法，該方法工藝簡單，得率高，能得到純度較高的重組亮氨酸氨肽酶。

附圖說明：

圖1.DEAE離子交換層析色譜圖；