[發明專利]一種利用農桿菌介導的光皮樺轉基因方法

無效

• 申請號: 201210343867.8
• 申請日: 2012-09-17
• 公開（公告）號: CN102978235A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 童再康;李美飛;黃華宏;樓雄珍;姜小鳳
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.技術領域

本發明涉及一種利用農桿菌介導培養轉基因光皮樺的方法。

2.背景技術

光皮樺(Betula?luminifera?H.Wink.)為樺木科樺木屬的落葉高大喬木，天然分布于我國秦嶺、淮河流域以南的14個省區，是木材材質優良的闊葉珍貴用材樹種，且具有耐貧瘠、速生、開花早等特性，現已成為中國南方地區杉木、松樹地更新的最重要珍貴造林樹種，也是良好的林木遺傳學研究材料。該樹種的育種工作已全面啟動，在不同種源區選擇了優良單株，并進行雜交創制新種質，建立其轉基因技術平臺對于開展光皮樺分子育種，創制抗蟲、抗旱新種質以及驗證已克隆基因的功能等均具有十分重要的作用。

轉基因技術指利用分子生物學技術，將某些抗逆、抗病蟲等已知功能性狀的基因，通過現代科技手段移植到目標生物體中，從而對植物各種性狀進行改良的方法。其常用的方法有：農桿菌介導法；基因槍法；電擊和聚乙二醇(PEG)法和花粉管通道法。迄今為止，國內外已得到60種以上轉基因植物，其中棉花、煙草和大豆等已大面積種植。通過轉基因技術，可以改變光皮樺的遺傳物質，提高其抗蟲、抗旱和木材品質，從而降低生產成本，提高經濟效益。

CN200910113862.4公開了諶紅輝的“光皮樺葉芽組織培養快速繁殖技術”發明專利技術，以光皮樺葉芽為外植體，誘導再生植株，這種方法雖然繁殖系數較高，但選材時間較難，而采用種子和葉片作為外植體采樣比較方便且可以多次采集。

3.發明內容

本發明要解決的技術問題是建立光皮樺組培體系并利用農桿菌介導培養光皮樺轉基因植株。

解決上述技術問題的技術方案是按如下步驟進行：

(1)培養基配方

預培養培養基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L(PH5.9)

共培養培養基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L+AS300μmol/L(PH5.5)

選一培養基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L+Carb500mg/L+Hyg10mg/L

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選二、選三培養基配方：MS+BA0.5mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L+Carb500mg/L+Hyg10mg/L

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生根培養培養基配方：1/2MS+IBA1mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5.5g/L???(PH5.9)

AS(乙酰丁香酮)、Carb(羧芐青霉素)和Hyg(潮霉素)都在培養基倒板前溫度低于50℃時再加入，防止失效。

(2)光皮樺組培苗的準備

A：種子消毒滅菌：將收集的光皮樺種子放入50ml無菌離心管中，倒入70％酒精消毒1-2分鐘；倒去酒精，加入40ml?0.1％升汞溶液，浸泡5min；倒去升汞溶液，用無菌蒸餾水清洗種子4-5遍。

B：小苗誘導與繼代培養：將滅好菌的種子放在無菌濾紙上吸干水分，置入MS培養基中；操作完畢后用封口膜(MicroporeTM?Surgical?Tape)封好培養皿，在25℃-28℃下光照培養2周；將發芽的小苗置入繼代培養基1/2MS，每瓶3-4株，培養2-3個月(25℃-28℃下光照培養)。

(3)預培養

選取長勢較好的組培苗的葉片為外植體。選取其前3片較幼嫩的葉片，用剪刀在葉片上剪2-3道傷口(深達葉脈)，較大的葉片可剪成0.5cm大小，接入預培養培養基，每皿40-50片，暗培養7天。

(4)農桿菌培養

挑取農桿菌單克隆或吸取所保藏的農桿菌菌液100μl于5mlYEP(含50mg/LKan和50mg/LStr)培養基中，28℃，250rpm振蕩培養20-36h至飽和，再按0.2％-0.3％的比例，轉入含有抗生素的YEP培養基中，相同條件下培養12-16h，當0D600的值為0.8-1.0時即可用于轉化。

(5)轉化和共培養