[發(fā)明專利]一種促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210342707.1
• 申請(qǐng)日: 2012-09-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102823581A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 申曉輝;任麗;張荻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): A01N3/00
• 分類號(hào): A01N3/00
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

1.一種促進(jìn)玻璃化超低溫保存的外源物質(zhì)的篩選方法，其特征在于，為以擬南芥幼苗為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將外源物質(zhì)添加到玻璃化溶液中用于擬南芥幼苗的玻璃化超低溫保存，以不添加外源物質(zhì)處理的擬南芥幼苗為對(duì)照，通過(guò)恢復(fù)生長(zhǎng)率的比較評(píng)價(jià)外源物質(zhì)的效果。

2.如權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，具體步驟如下：

1）擬南芥幼苗的獲得：將擬南芥種子春化處理后，培養(yǎng)0～72h，獲得不同苗齡的擬南芥幼苗；

2）將不同苗齡的擬南芥幼苗分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行玻璃化超低溫保存，實(shí)驗(yàn)組的玻璃化溶液中添加外源物質(zhì)，對(duì)照組不添加；

3）將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組玻璃化超低溫保存后的幼苗解凍、恢復(fù)培養(yǎng)后，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組內(nèi)苗齡相同的擬南芥幼苗的恢復(fù)生長(zhǎng)率。

3.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟1）所述春化條件為0～10℃，春化處理時(shí)間為24～72h。

4.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟1）所述培養(yǎng)是在MS固體培養(yǎng)基上，每天先光照培養(yǎng)8～12h，光強(qiáng)100～200μmol?m^-2，培養(yǎng)溫度20～27℃；然后黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20～25℃。

5.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟1)獲得的擬南芥幼苗的苗齡分別為0、48、51、54、57、60、63、66、69、72h。

6.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟2）所述玻璃化超低溫保存方法為：將擬南芥幼苗放入裝載液中，室溫處理20～30min；將裝載液吸除后，加入玻璃化溶液0℃處理40～60min；將置于玻璃化溶液中的擬南芥幼苗放入液氮中保存0.5～2h。

7.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟2）所述裝載液為含有2M甘油，0.4M蔗糖的MS培養(yǎng)液；所述玻璃化溶液為含有30%w/v甘油，15%w/v乙二醇，15%w/v二甲基亞砜和0.4M蔗糖的MS培養(yǎng)液。

8.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟3）所述解凍方法為：將超低溫保存的擬南芥幼苗從液氮中取出，35～40℃水浴解凍60～120s；將玻璃化溶液吸除，加入洗滌液室溫處理30～50min，每隔5～10min換一次洗滌液；所述洗滌液為含有1.0～1.2M蔗糖的MS培養(yǎng)液。

9.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，步驟3）所述恢復(fù)培養(yǎng)為將洗滌后的幼苗移到MS固體培養(yǎng)基中，每天先光照培養(yǎng)8～12h，光強(qiáng)100～200μmol?m^-2，培養(yǎng)溫度20～27℃；然后黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20～25℃。

10.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，在擬南芥幼苗恢復(fù)培養(yǎng)的第15天統(tǒng)計(jì)成活的擬南芥幼苗的數(shù)量，計(jì)算恢復(fù)生長(zhǎng)率，所述恢復(fù)生長(zhǎng)率=成活的幼苗數(shù)量/幼苗總數(shù)量×100%。

11.權(quán)利要求1-10任一權(quán)利要求所述篩選方法篩選獲得的抗壞血酸、脫落酸、甜菜堿、還原型谷胱甘肽之任一在玻璃化超低溫保存中的應(yīng)用。