[發明專利]親和層析基質及其制備和使用方法

有效

• 申請號: 201210342435.5
• 申請日: 2007-01-05
• 公開（公告）號: CN103028380A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 卞南英;J．查庫迪恩;N．索伊斯;J．烏瑪納;王陳
• 申請（專利權）人: EMD密理博公司
• 主分類號: B01J20/281
• 分類號: B01J20/281;B01J20/30;C07K1/22
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路

本申請為申請日為2007年1月5日、申請號為200780001886.X、發明名稱為“親和層析基質及其制備和使用方法”的發明專利申請的分案申請。

本申請要求以2006年1月6日遞交的美國臨時申請60/756,873號作為優先權，通過引用的方式將其全部內容并入本文。

發明領域

本發明主要涉及層析領域。在一些特定實施方式中本發明提供了涉及親和層析的基質及方法。

發明背景

層析方法一般用于從混合物中分離和/或純化目標分子如蛋白質、核酸和多糖。親和層析具體包括使混合物通過連有特異性配體（即特異性結合配偶體）的基質，以使目標分子結合于其上。通過接觸配體，目標分子結合到基質上并因此從混合物中保留下來。相比于其他類型的層析，親和層析提供了一些優點。它提供了一種高特異性、快速、經濟和高產率的純化方法。

在一個應用中親和層析可被用于純化如單克隆抗體的蛋白質。比如IgG亞型抗體可通過結合有A蛋白或G蛋白的基質而得到親和純化（Boyle?and?Reis,1987,Biotechnology?5:697;Hermanson?et?al.,1992,Immobilized?Affinity?Ligand?Techniques,Academic?Press;美國專利公開2006/0134805號）。

連接蛋白質配體的方法過去已被描述，如將A蛋白和G蛋白連接到固體支持物例如層析介質上，參見，例如Hermanson?et?al.1992,Immobilized?Affinity?Ligand?Techniques,Academic?Press;美國專利5,874,165號;3,932,557號;4,772,635號;4,210,723號;5,250,6123號;歐洲專利申請EP?1352957A1,WO?2004/074471。典型地，這種介質是用反應官能團（“活化基團”）如環氧化物（表氯醇）、氰（溴化氰CNBr），N,N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯（DSC）、醛或活化的羧酸（如N-羥基丁二酰亞胺（NHS）酯、羰基二咪唑（CDI）活化酯）來活化的。這些活化基團能直接連接到基礎基質，如CNBr，或者它們也可以是“接頭”或間隔分子的一部分，典型地是碳、氧和氮原子的直鏈，如在接頭丁二醇二縮水甘油醚（一種常用的環氧化物偶聯劑）中發現的碳和氧的十元鏈。在偶聯條件下再將活化介質與蛋白質配體相平衡。一旦偶聯反應完成，徹底洗滌介質。對于A蛋白，通常每毫升介質可負載4-6毫克蛋白質（配體密度），形成IgG的最大靜態容量（Qs）為40g/L。蛋白質配體密度決定了靜態容量。靜態容量給出了能在層析分離中應用的蛋白質容量的上限。一般動態容量或者說負載容量（Qd）在一定的介質中與靜態容量相關。

一種適合于連接到瓊脂糖支持物上的重組形式的A蛋白也已被描述。重組形式的蛋白質被工程化以具有半胱氨酸末端，參見，例如美國專利6,399,750號;GE?Healthcare?Product?Literature?for?r-Protein?A?Sepharose?Fast?Flow，and?Mabselect運用該種重組A蛋白，IgG的靜態容量已能達到55-70g/L。然而，應用該種重組A蛋白的一個局限是其必須經基因工程化以包含選擇性偶聯官能團，由此導致的耗時和昂貴。

另一種將蛋白質配體偶聯到固體支持物上的策略是“接頭輔助偶聯”。接頭輔助偶聯與以下要詳述的配體輔助偶聯相反，它的特點是依賴于一個包含了配體（即待純化靶分子的特異結合配偶體）和有助于將配體偶聯到固體支持物上的適當連接官能團的單分子。這種技術包括將官能團（如帶電的胺）工程化設計為能偶聯目標蛋白質配體的接頭或間隔區。這些體系中的接頭也含有將蛋白質偶聯到接頭上的活化基團。接頭首先連接到固體支持物，再與蛋白質接觸。因此單分子接頭同時起著將蛋白質共價連接到基質和非共價地與蛋白質相互作用的功能。這提供了在偶聯反應前/中實體的預先連接。這一技術已用于將聚糖偶聯到膜表面以進行膜印跡凝膠電泳（美國專利5,543,054號;Charkoudian?et?al.,1995,Analytical?Letters,28:1055）。