[發明專利]原蛋白轉化酶2基因在制備治療癌癥藥物中的應用

有效

• 申請號: 201210341752.5
• 申請日: 2012-09-14
• 公開（公告）號: CN102989008A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 唐松山;吳文峰;李紅枝;李謙;張娟輝;周東
• 申請（專利權）人: 廣東藥學院
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種原蛋白轉化酶2基因在制備治療癌癥藥物中的應用，特別是治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌癥藥物中的應用。?

背景技術：

原蛋白轉化酶（Subtilisin-like?Proprotein?Convertases，SPCs或PCs）是一類蛋白內切加工酶，它們介導了與胚胎形成、基因表達、細胞周期、凋亡和神經內分泌等功能活動的相關前體蛋白的加工和成熟。這些前體蛋白分子的成熟需要涉及多個加工酶的分子加工步驟。目前，這些屬于絲氨酸蛋白酶家族的原蛋白轉化酶有PC1（或PC1/3），PC2，PC4，Furin，PACE4，PC5/6，PC7，SKI-1和PCSK9等9種。它們在脊椎動物功能細胞中單獨或共同表達，在時間和空間上起作用。已經證實，哺乳類原蛋白轉化酶與許多疾病相關，如癌癥、腦卒中、青光眼等。原蛋白轉化酶2（PC2）廣泛地表達在內分泌組織中，在原蛋白加工成熟中伴有基礎的角色。Tanaka?S等和Sang-Nam?L等報道，在高Ca²⁺、pH5.0和其它原蛋白轉化酶存在下，鼠PC2原蛋白（proPC2，637aa/74kDa)裂解成成熟的PC2酶(529aa/64kDa)。在這個加工成熟過程中，proPC2蛋白分子的正確折疊需其分子伴侶7B2蛋白（21kDa）的幫助。文獻報道，在人pc2基因（1914bp/638aa）和小鼠pc2基因（1911bp/637aa）之間有96.55%同源性；在大鼠和小鼠之間，pc2基因有99.53%同源性，這顯示：pc2基因在人和鼠之間有極高度保守性。PC2是內肽酶，許多文獻報道，前體蛋白的成熟需要PC2作用。神經內分泌肽前體蛋白到成?熟通常有三種形式，帶有信號肽的前原蛋白（pre-pro-protein），原蛋白（pro-protein）和成熟肽。這些加工過程是由信號肽酶和PCs系統起作用。?

發明內容：

本發明的第一個目的是提供原蛋白轉化酶2基因在制備治療癌癥藥物中的應用，特別是在制備治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌癥藥物中的應用。?

本發明所述的原蛋白轉化酶2基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。?

本發明的第二個目的是提供原蛋白轉化酶2在制備治療癌癥藥物中的應用，特別是在制備治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌癥藥物中的應用，所述的原蛋白轉化酶2，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2的第109~637位所示。?

本發明的第三個目的是提供編碼原蛋白轉化酶2的基因在制備治療癌癥藥物中的應用，特別是在制備治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或小鼠黑素瘤等癌癥藥物中的應用。?

所述的編碼原蛋白轉化酶2的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1的第325~1911位所示。?

本發明將原蛋白轉化酶2基因和7b2基因分別插入表達載體pCDNA3.1中，形成表達載體pCDNA3.1-pc2和pCDNA3.1-7b2。將重組細菌培養，重組質粒用通用的DNA純化試劑盒抽提后，通過脂質體介導將pCDNA3.1-pc2和pCDNA3.1-7b2重組質粒共轉染人肺癌細胞A549、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF、小鼠乳腺癌細胞4T1和小鼠黑色素瘤細胞B16。應用MTT法測定pc2重組質粒對上述癌細胞的半數起效量IC50分別為94.20、0.02、8.11、1.39和2.23（μg/50μl）。由此可見本發明的原蛋白轉化酶2基因對人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF、小鼠乳腺癌細胞4T1和小鼠黑色素瘤細胞B16具有較好的抑制作用，這?顯示，pc2基因對人和鼠癌癥有同樣的效果。因此可以將原蛋白轉化酶2基因用于制備治療人肺癌或人肝癌或人乳腺癌或小鼠乳腺癌或黑素瘤等癌癥藥物中。?

再通過脂質體介導，將質粒pCDNA3.1-pc2和pCDNA3.1-7b2基因共轉染小鼠乳腺癌細胞株4T1，結果顯示，轉染小鼠乳腺癌細胞株4T1具有最高的PC2酶活性和明顯的PC2蛋白表達。轉染48小時后，培養液中出現大量的懸浮細胞，與相同細胞密度的轉染空載體pCDNA3.1的瘤細胞比較，共轉染組貼壁細胞明顯減少，不同密度瘤細胞的共轉染引起相同的凋亡現象。貼壁細胞熒光染色（DAPI）顯示，部分癌細胞核裂解成碎塊和TUNEL反應陽性，顯示有明顯細胞死亡。?