[發明專利]一種激光掃描位相顯微成像方法及系統

有效

• 申請號: 201210338703.6
• 申請日: 2012-09-13
• 公開（公告）號: CN102841083A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 丁翼晨;謝浩;席鵬
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G02B21/36
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 徐寧;關暢

1.一種激光掃描位相顯微成像方法，包括以下步驟：

1）設置一包括有熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描系統和光電探測系統的激光掃描位相顯微成像系統；其中，所述熒光顯微鏡包括有物鏡、管鏡和掃描鏡；所述激光共聚焦掃描系統包括有激光器、二向色鏡、X方向掃描振鏡、Y方向掃描振鏡、濾波片、會聚透鏡和針孔；

2）將激光共聚焦掃描系統放置在熒光顯微鏡的入光孔處，將光電探測系統放置在激光共聚焦掃描系統的出光方向，使激光器出射激發光的高度與熒光顯微鏡入光孔中軸線的高度相當；

3）調節各光學元件之間的角度，使成像系統滿足光學顯微系統的物象共軛關系；

4）將一樣品切片放置在熒光顯微鏡的試驗臺上，所述樣品切片包括蓋玻片、生物樣品以及載玻片；

5）在載玻片上添加熒光介質；

6）激光器發射激發光經二向色鏡進行分光，出射的激發光依次經X方向掃描振鏡和Y方向掃描振鏡掃描成光柵面，并將其經掃描鏡和管鏡聚焦擴束后發射到物鏡，并經蓋玻片聚焦在生物樣品上；

7）聚焦在生物樣品的激發光透過生物樣品照射熒光介質，熒光介質被激發光激發發射熒光；

8）熒光照射并透過生物樣品沿著原光路返回，即依次經物鏡、管鏡、掃描鏡、Y方向掃描振鏡、X方向掃描振鏡發射到二向色鏡進行分光，出射的熒光發射到濾波片并經會聚透鏡聚焦進入針孔，經針孔出射的熒光由光電探測系統接收處理得到生物樣品的浮雕狀結構。

2.如權利要求1所述的一種激光掃描位相顯微成像方法，其特征在于：所述步驟3）中調節各光學元件之間的角度具體操作為：調節X方向掃描振鏡與物鏡之間的角度，使進入物鏡前的激發光光軸方向與物鏡中軸線之間的角度為θ，α₁〈θ〈α₂，其中，α₁為激發光掃描視場角，α₂為物鏡的數值孔徑角。

3.如權利要求1所述的一種激光掃描位相顯微成像方法，其特征在于：所述步驟3）中調節各光學元件之間的角度具體操作為：調節X方向掃描振鏡與物鏡之間的角度，使進入物鏡前的激發光光軸方向與物鏡的中軸線重合，并調節會聚透鏡與針孔之間的位置，使經會聚透鏡聚焦的熒光與針孔中軸線之間的角度為β，α₁·γ〈β〈α₂·γ，其中，γ為角放大率，α₁為激發光掃描視場角，α₂為物鏡的數值孔徑角。

4.如權利要求1所述的一種激光掃描位相顯微成像方法，其特征在于：所述步驟3）中調節各光學元件之間的角度具體操作為：調節X方向掃描振鏡與物鏡之間的角度，使進入物鏡前的激發光光軸方向與物鏡的中軸線之間的角度為δ₁，同時調節會聚透鏡與針孔之間的位置，使經會聚透鏡聚焦的熒光與針孔中軸線之間的角度為δ₂，其中，δ₁〉0，δ₂〉0，α₁〈δ₁+δ₂/γ〈α₂，γ為角放大率，α₁為激發光掃描視場角，α₂為物鏡的數值孔徑角。

5.實現如權利要求1或2或3或4所述方法的一種激光掃描位相顯微成像系統，其特征在于：它包括熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描系統和光電探測系統，所述熒光顯微鏡包括物鏡、管鏡和掃描鏡；所述激光共聚焦掃描系統包括激光器、二向色鏡、X方向掃描振鏡、Y方向掃描振鏡、濾波片、會聚透鏡和針孔；所述激光共聚焦掃描系統設置在所述熒光顯微鏡的入光孔處，所述光電探測系統設置在所述針孔的出光方向，所述激光器發射激發光到所述二向色鏡進行分光，經所述二向色鏡出射的激發光依次經所述X方向掃描振鏡和Y方向掃描振鏡沿X方向和Y方向掃描成光柵面，光柵面經所述掃描鏡聚焦進入所述熒光顯微鏡，并依次經所述管鏡和物鏡聚焦于生物樣品并照射熒光介質，經激發光激發的熒光照射并透過生物樣品，沿著所述物鏡、管鏡和掃描鏡射出，并依次通過所述Y方向掃描振鏡和X方向掃描鏡發射到所述二向色鏡進行分光，經所述二向色鏡出射的熒光經所述濾波片和會聚透鏡聚焦進入所述針孔，并經所述針孔出射到所述光電探測系統上完成生物樣品的熒光成像。