[發明專利]一種檢測活動性肺結核病的試劑盒

有效

• 申請號: 201210338287.X
• 申請日: 2012-09-13
• 公開（公告）號: CN103045723A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 李繼承;張星
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/32
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明屬于血清生物學標志物研究，涉及檢測活動性肺結核病特異的miRNA的試劑盒，通過一種能鑒定活動性肺結核病特異的miRNA去捕獲血清生物學標志物，并用有定量控制的miRNA分析，在血清中檢測活動性肺結核病。

背景技術

肺結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性肺部感染性疾病，是嚴重威脅人類健康的疾病。中國流行形勢十分嚴峻；現有活動性肺結核病患者約130萬例，新發病例145萬例/年，每年新發病例占全球人口總數的18%，死亡人數達13萬例/年，超過了其他傳染病死亡人數的總和。肺結核病的高發病和死亡率，以及通過空氣傳播，對病人、病人所接觸的事物和社會都產生相當大的負擔。因此，對肺結核病患者及時早期診斷是控制傳染源，遏制肺結核病流行的最重要措施。目前，臨床常規應用的診斷方法均有顯著缺陷，如痰涂片檢測--靈敏度低；結核分支桿菌培養--陽性率低（約30%）且耗時久（長達6-8周）；胸部X線檢查--無肺結核病特征性改變；PCR檢測--假陽性和假陰性均高；結核菌素試驗--不能區分結核自然感染和卡介苗接種；血清結核抗體檢測--靈敏度和特異性均不理想。因此，迫切需要發現一種特異性強的新的生物學標志物，建立快速、敏感、高效的診斷技術，防止肺結核疾病蔓延。

近年來研究表明，血清中的miRNAs能作為診斷疾病的候選生物學標志物，研究涉及前列腺癌、肝癌、肺癌、大腸直腸癌、乳腺癌、白血病及卵巢癌等多種腫瘤，且血清是方便和容易得到的樣品，從血清中尋找疾病生物標志物一直以來是人們研究的熱點。由于miRNAs不易在血液中被各種酶降解，并且具有組織和細胞特異性，能夠用于疾病分子診斷和疾病預后預測，適合作為疾病的候選生物學標志物。根據疾病生物標志物研究的要求，應用1-2個miRNAs作為疾病標志物，特異性低。同時由于不同患者的個體差異，使得僅用1-2個miRNAs判斷疾病顯得極不可靠。應該篩選出一組miRNAs，建立miRNAs的組合物可使結果更加可靠。所以，研究活動性肺結核病患者特異的血清miRNAs的組合物，作為生物標志物，對早期診斷肺結核病具有重要的意義。然而，目前尚無肺結核病特異血清miRNAs組合物的研究報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測活動性肺結核病的診斷試劑盒，該試劑盒由RNA提取緩沖液，活動性肺結核病特異的血清miRNA組合物、內參反轉錄引物、PCR引物以及熒光定量RT-PCR反應液構成，其中活動性肺結核病特異的血清miRNA組合物由4個差異表達的血清miRNAs組成：hsa-miR-29c、hsa-miR-22、hsa-miR-320b和hsa-miR-101。

RNA提取緩沖液：QIAzol^??Lysis?Reagent、氯仿、無水乙醇、RWT溶液、RPE溶液和RNAase-free水。

熒光定量RT-PCR反應液：包括反轉錄和熒光定量PCR反應液；反轉錄反應液：總RNA、反轉錄引物（2?μM）、5×反應緩沖液、dNTP（10?mM）、RNase抑制劑、反轉錄酶；熒光定量PCR反應液：SYBR^?Premix?Ex?Taq?（Tli?RnaseH?Plus）（2×）、PCR上游引物（10μM）、PCR下游引物（10μM）、ROX?Reference?Dye（50×）、模板cDNA和ddH₂O。

逆轉錄引物序列為：

hsa-miR-29c：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’；

hsa-miR-22：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT-3’；hsa-miR-320b：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCGTT-3’；hsa-miR-101：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGT-3’；內參hsa-miR-16：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’。

PCR上游引物序列

hsa-miR-29c：5’-GGCGGTAGCACCATTTGAA-3’；?

hsa-miR-22：5’-CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA-3’；