[發明專利]焦磷酸測序法檢測ALDH2基因多態性的試劑盒及方法

無效

• 申請號: 201210337985.8
• 申請日: 2012-09-13
• 公開（公告）號: CN102876782A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 周宏灝
• 申請（專利權）人: 周宏灝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體的是涉及焦磷酸測序法檢測ALDH2基因多態性的試劑盒及方法。

背景技術

酒精耐受(Alcohol?Tolerance)主要指身體對酒精性飲料或食物中乙醇的敏感性下降，包括直接耐受性和誘導耐受性。直接酒精耐受性與個人體型大小有關，誘導耐受指長期飲酒導致的酒精耐受性增高。研究表明環境因素和遺傳因素共同影響酒量的個體差異，酒精依賴和酒精過敏很大程度由傳因素決定，如乙醛脫氫酶2(ALDH2)是乙醇氧化代謝的主要代謝酶，酒精耐受性與ALDH2的酶活性有關，其多態性也是引起酒精耐受個體差異的主要原因(Circ?J.2011.75(4):911-8)。

ALDH2基因在rs671位點突變后，使504位谷氨酸被賴氨酸替換，突變雜合子(AG)使該酶活性降低，純合突變(AA)該酶活性消失。該突變使酒精耐受性平均降低84%。

ALDH2基因rs671位點突變與酒精耐受性風險關系(Hypertens?Res.2009.32(3):207-13)

飲酒是全球普遍流行的的生活方式，但研究表明長期過度飲酒是動脈粥樣硬化發病的一個危險因素，如高血壓，肥胖，血脂異常以及糖尿病等都與飲酒有關。同時，流行病學研究顯示適度的喝酒可通過各種機制降低心血管疾病，如適度飲用溫和的酒有利于糖代謝及影響高密度脂蛋白的水平，則會導致高血壓及高血脂癥，因此通過對ALDH2基因的突變檢測，讓你了解自己是否能喝酒，酒量如何，耐受程度怎樣，幫助你子啊生活中正確控制飲酒量，減少過度飲酒帶來身體上的傷害。

同時研究也發現，ALDH2基因多態性與硝酸甘油的用藥有關。ALDH2酶是硝酸甘油有效代謝物NO形成的關鍵。當ALDH2基因在rs671位點突變后，酶活性降低，硝酸甘油在體內生物轉化過程受阻，有效活性產物NO生成減少，進而導致硝酸甘油治療心絞痛效果降低。值得注意的是，在亞洲人群中，30%-50%的人都攜有rs671位點突變，遠遠高于歐美人群。國內研究還發現，中國漢族人群中，含服硝酸甘油無效的比例高達25%以上，基因多態性起到了非常重要的作用。因此，對ALDH2基因多態性檢測，有助于臨床上對硝酸甘油的合理使用。

綜上，開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測ALDH2基因多態性檢測試劑盒對酒精耐受評估及硝酸甘油的合理使用，具有重要的臨床意義。

焦磷酸測序(Pyro?sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是一種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容

本發明旨在提供一種焦磷酸測序法檢測ALDH2基因（SEQ?ID?NO.1）多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測ALDH2SNP。

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：

一種焦磷酸測序法檢測ALDH2基因多態性的試劑盒，包括如下引物：

（1）擴增引物：

上游引物：5′-GATGTGTTTGGAGCCCAGTC-3′（SEQ?ID?NO.2）；

下游引物：5′-CAGGTCCCACACTCACAGTTTTC-3′（SEQ?ID?NO.3）；

其中，下游引物的5′進行生物素標記；

（2）測序引物：5′-GCTGCAGGCATACAC-3′（SEQ?ID?NO.4）；

試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑。

一種應用上述試劑盒檢測ALDH2基因多態性的方法，包括如下步驟：

（1）DNA提取；

（2）聚合酶鏈反應：

配制50μl?PCR擴增體系，包含：10×PCR?buffer?5.0μl，dNTP?1.5μl，ALDH2上游引物0.5μl，ALDH2下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水41.0μl，模板1.0μl；循環程序為：95°C?5min預變性；依次在95°C?30S，50°C?30S，72°C?30S，進行35個循環；72°C保持5min，最終保持在4°C，得擴增產物；

（3）焦磷酸測序單鏈樣本純化；

（4）焦磷酸測序及結果分析。