[發(fā)明專利]一種水洗一次的革蘭染色二步法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210336839.3
• 申請日: 2012-09-12
• 公開（公告）號: CN103674660A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉元康
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫飛伊生物科技有限公司
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種革蘭染色法，特別是涉及一種水洗一次的革蘭染色二步法。

背景技術(shù)

革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫革蘭氏陽性菌（G+），后者叫革蘭氏陰性菌（G-）。為了觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽孢的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。

革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有很多差別，染色反應(yīng)不一樣。現(xiàn)在一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度低，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的主要依據(jù)。另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多，因此不易脫去，陰性菌則相反。所以染色時的條件要嚴(yán)格控制。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH很低時，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類菌的細(xì)胞壁等對結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。所以脫色時間，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格控制。

傳統(tǒng)的革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具體操作方法是：1）涂片固定，2）草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘，3）水沖洗，4）加碘液覆蓋涂面染1分鐘，5）水洗，用吸水紙吸除水分，6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后水洗，吸去水分，7）蕃紅染色液染10秒鐘后，自來水沖洗，干燥鏡檢。其中在初染、媒染、脫色、復(fù)染每一步驟之后都需要水洗除去染料，避免附著的染料對染色效果的影響，革蘭染色四步法效果好，但操作比較復(fù)雜，質(zhì)量控制不易進行，難以做到標(biāo)準(zhǔn)化，同時消耗大量的染料和水，容易造成資源的浪費和環(huán)境的污染。

目前在專利CN101126689B中公開了一種水洗兩次的革蘭染色二步法，主要包括初染和復(fù)染兩步，在每一步驟之后同樣需要水洗除去附著的染料，該方法較傳統(tǒng)的革蘭氏染色四步法，操作更簡便且方法可靠，但此方法同樣消耗較多的染料和水，并且初染和復(fù)染的時間較長，不適于大批量的檢驗操作。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對目前革蘭染色二步法染料和水消耗較大，染色時間較長的問題，提供一種水洗一次的革蘭染色二步法，該方法染料和水的用量小，初染和復(fù)染時間短，適用于大批量的檢驗操作。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種水洗一次的革蘭染色二步法，包括：

在室溫下，將待檢材料均勻涂在玻片上，干燥，固定，再將初染劑滴加到涂片上，染色，傾去初染劑后直接滴加復(fù)染劑，染色，水洗一次，干后鏡檢，在涂片中央是染成紫色的革蘭陽性菌和染成紅色的革蘭陰性菌，

其中所述初染劑為含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.03125%結(jié)晶紫的水溶液；所述復(fù)染劑為含有以下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)組分的乙醇溶液，其中0.0625%堿性品紅、0.005%碘化鉀、0.001%碘。

在傳統(tǒng)的革蘭染色方法和改進的二步染色法中，由于所用染料量較多，水洗被認(rèn)為是不可缺少的一步，因為通過水洗可除去附著在涂片上的染料，避免對染色效果的影響，然而發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，使用稀釋的染色液，減少染料的用量，省去初染后的水洗步驟對染色效果沒有影響，染色效果仍與已知的方法一樣好。

本發(fā)明優(yōu)選地，所述初染劑的滴加量為1～4ml，初染劑染色時間為10～50秒；所述復(fù)染劑的滴加量為0.8～2ml，復(fù)染劑染色時間為1～5秒。

本發(fā)明更優(yōu)選為所述初染劑的滴加量為2ml，初染劑染色時間為30秒，所述復(fù)染劑的滴加量為1ml，復(fù)染劑染色時間為2秒。

優(yōu)選地，所述涂在玻片上的待檢材料的直徑為1.0～2.0cm。

本發(fā)明中，所述待檢材料優(yōu)選為細(xì)菌培養(yǎng)物或送檢分泌物。

本發(fā)明的水洗一次革蘭染色二步法具有以下優(yōu)點：

1.與現(xiàn)有的水洗兩次革蘭染色二步法相比，本發(fā)明的方法省略了初染后的水洗一步，簡化了操作步驟，方法更為簡便并且染色效果和水洗兩次革蘭染色二步法一樣，該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比可節(jié)約50%的水。

2.該方法大大減少了染料的用量，并且縮短了初染和復(fù)染的時間，提高染色效率的同時節(jié)約了50%的染料，減少了對環(huán)境的污染。