[發明專利]檢測東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列和試劑盒

無效

• 申請號: 201210336752.6
• 申請日: 2012-09-12
• 公開（公告）號: CN102808043A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 高志強;谷強;李海花;張偉;張鶴曉;劉環;蒲靜;喬彩霞;張利峰;吳亞瓊;于軍超;王慧珊
• 申請（專利權）人: 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 趙曉丹

技術領域

本發明涉及基于MGB短探針的熒光RT-PCR方法檢測東部馬腦炎病毒的核苷酸序列和試劑盒，尤指快速的基于MGB短探針針對對6K和E1靶區域的熒光定量RT-PCR檢測東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列和試劑盒，適用于東部馬腦脊髓炎病毒的快速分子生物學診斷和檢測，可用于東部馬腦脊髓炎病毒的檢測，出入境檢疫等，屬于動物檢疫領域。

背景技術

東部馬腦脊髓炎病毒（eastern?equine?encephalomyelitis?virus，EEEV）屬于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒屬（Genus?Alphavirus）的成員，病毒粒子呈球形，直徑60-65nm。有囊膜，囊膜上有糖蛋白纖突，核衣殼中包裹有單鏈的基因組RNA。是傳染性和致死率很高的人畜共患病，能感染以馬為代表的多種動物宿主，存在極大的潛在威脅，是目前國際社會列為防生物恐怖的主要種類之一。主要表現為發病急，持續高熱，有嚴重中樞神經系統癥狀。人感染后臨床表現與乙型腦炎很相似，對人致死率最高可達90%，EEEV為神經性甲病毒，可引起人和動物腦脊髓炎。自然狀態下，病毒在鳥類和蚊子之間交替感染，人和馬是該病毒的終末宿主。在馬和人群中呈散發流行。主要發生于仲夏到秋末期間；主要臨床癥狀為發熱、厭食和精神高度沉郁，對于亞臨床感染病例，病癥相對溫和。

在美國，該病小規模爆發幾乎年年都有，在東北部各州及佛羅里達，大量的馬匹散在發病，偶爾也有死亡數百匹馬的嚴重暴發。地方性EEEV的十分局限的滋生地可能反映它對媒介——黑尾賽蚊的嚴格需求。這種蚊越冬時成為幼蟲，它需要陰暗、富含有機質的潮濕環境。美國東部有這樣的環境。另外成年蚊的群體密度可以反映諸如雨量和溫度等氣候因素的變化。東方型馬腦炎流行的條件是在地方性流行地既需要大量的黑尾賽蚊群及與之相適應的易感鳥群，同時還需要兼有嗜鳥血習性和嗜人或馬血習性的其他蚊群作為疫病的傳播媒介。這樣復雜的條件就限制了東方型馬腦炎的分布與流行范圍，所以該病在動物和人群中的發生概率較低，而且地理上嚴格地限制在地方性流行區域。

主要呈蚊－鳥傳播方式。蚊是病毒的傳播媒介，鳥是病毒的貯存宿主，該病毒在鳥類體內大量增值后，可以借助媒介昆蟲而擴大傳播范圍。蚊在吸食含有病毒的血液后，病毒可在蚊體內增值并可達較高滴度，并持續終生存在。不同種蚊對病毒的感染閾（能使1％－5％蚊感染的病毒量）不同。其中，黑尾塞蚊（Culiseta?melanura）是鳥類中EEEV的主要傳播媒介。鳥類對EEEV十分易感，在病毒傳播過程中，它們扮演著極為重要的角色，起著擴大感染宿主范圍的作用。本病的傳播與蚊和鳥類的分布密切相關。此外，EEEV還存在蚊－蚊傳播方式。其他無脊椎動物如螨、鼠、蛇等嚙齒類和爬行類動物在傳播EEEV上也有一定意義。本病不會經氣溶膠傳播。

EEEV為單股正鏈RNA病毒，全長分別為11.7kb。它們具有甲病毒屬特征的4個保守區，5’端前46nt形成帶柄的環狀，NSP1編碼區內形成帶柄環狀，由24nt組成的42S與26S的結合部，位于3’端后和PolyA尾前19nt組成的區域。基因組編碼4種非結構蛋白（NSP1～4）和5種結構蛋白（衣殼蛋白C，包膜糖蛋白E1、E2、E3，6K，基因排列順序為5’-C-E3-E2-6K-E1-3’）。其中26S亞基因組RNA編碼衣殼蛋白、包膜糖蛋白E1/E2和6K信號肽。E2蛋白是該病的主要保護性抗原，具有7個部分重疊的抗原表位，分別與血凝抑制、中和病毒和抗病毒感染活性有關，而E2-1區中的C區是甲病毒屬特異性抗原表位，含病毒與細胞作用的受體。

東部馬腦脊髓炎為我國一類動物疫病，國家質量監督檢驗檢疫總局將其列為出入境檢驗檢疫一類動物疫病，隨著動物國際貿易的日益繁榮，特別是各大型國際體育賽事的日益頻繁，出入境的馬匹越來越多，同時由于參賽馬匹來自不同的國家和地區，健康狀況參差不齊，疫情非常復雜，這些因素都可能危害我國養馬業的發展和馬術運動的正常開展，因此開展東部馬腦脊髓炎的檢測技術就顯得尤為重要。