[發(fā)明專利]檢測(cè)雞IGFBP-3基因第二號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210336645.3
• 申請(qǐng)日: 2012-09-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103103252A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 俞亞波;王金玉;顧云飛;顧玉萍;金崇富;邱聰;施會(huì)強(qiáng);張跟喜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司;揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 南京正聯(lián)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32243
• 代理人: 盧海洋

1.檢測(cè)雞IGFBP-3基因第二號(hào)外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征是包括如下步驟：

一、設(shè)計(jì)雞IGFBP-3基因第二外顯子區(qū)域PCR引物

以NCBI?所公布的雞NC_006089序列為參考，設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增包含雞IGFBP-3基因第二外顯子區(qū)域的引物P，其序列如下：

上游引物為：CATCTTGGGACCAGTGCTTT??20；

下游引物為：ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG??20；

二、以引物P進(jìn)行PCR擴(kuò)增待測(cè)雞的IGFBP-3基因片段

a、雞樣本的采集

采集多個(gè)地方的雞種作為檢測(cè)對(duì)象，以包含雞IGFBP-3基因的待測(cè)雞全基因組DNA為模板；

b、待測(cè)雞全基因組DNA模板處理

對(duì)上述含雞IGFBP-3基因的待測(cè)雞全基因組DNA模板進(jìn)行分離、提取、純化；

c、PCR擴(kuò)增雞IGFBP-3基因片段

PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，加入到1個(gè)1.5ml離心管中，充分混勻后瞬時(shí)離心，再分裝到每個(gè)96孔平板中，然后加入經(jīng)過(guò)步驟b處理后的待測(cè)雞全基因組DNA模板，再瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述PCR反應(yīng)體系總量為19—25μL，其包括10×PCR?Buffer?2.0—3.0μL、濃度為25mmol/L的Mg^2+??2.2—2.5μL，濃度為2?mmol/L的dNTPs?0.8—1.5μL，濃度為10?pmol/μL的上、下游引物各1μL，濃度為5?U/mL的TaqDNA聚合酶0.2—0.6μL，濃度為100?ng/μL的DNA模板1?.0—1.5μL，超純水11.8—12.5μL，擴(kuò)增程序?yàn)椋嚎刂茰囟葹?2—96?℃，對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行預(yù)變性處理4—6?min，保持溫度在92—96?℃，變性處理50—70?s，然后降低溫度至54—58?℃，進(jìn)行退火處理20—40?s，退火處理完畢后，升高溫度至70—74?℃，再進(jìn)行延伸處理20—40s，將上述的變性處理——退火處理——延伸處理三個(gè)步驟按上述的順序和工藝要求重復(fù)30—35個(gè)循環(huán)，操作完成后控制溫度為70—74?℃，延伸處理9—10?min，再降低溫度至9—10?℃，對(duì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行保存；

三、MspI酶切反應(yīng)消化PCR擴(kuò)增的IGFBP-3基因片段

?MspI酶切反應(yīng)消化體系包括4.6—5.2μL?PCR產(chǎn)物，限制性內(nèi)切酶MspI5U，10×Buffer?0.8—1.1?μL，雙蒸水5—6?μL，酶切消化條件為：65℃恒溫水浴消化6—8h；

四、MspI消化PCR產(chǎn)物后聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

a、制作濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠，點(diǎn)樣后采用180V電壓電泳25—35min，電泳結(jié)束后EB染色；

b、待分子量不同的待測(cè)雞全基因組DNA分離清晰時(shí)，在柯達(dá)凝膠成像系統(tǒng)成像；

c、根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分析SNP多態(tài)性；

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定雞IGFBP-3基因第1087位的單核苷酸多態(tài)性為：CC型表現(xiàn)為95bp和66bp兩條條帶，CT基因型表現(xiàn)為161bp、95?bp和66?bp三條條帶，TT基因型表現(xiàn)為161bp一條條帶；

d、不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物測(cè)序的序列驗(yàn)證

對(duì)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行正反雙向測(cè)序，同時(shí)，進(jìn)行SNP位置分析；

五、進(jìn)行雞IGFBP-3基因SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析；

六、進(jìn)行雞IGFBP-3基因SNP位點(diǎn)基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析

第1087位點(diǎn)的TT基因型可以作為一個(gè)提高雞產(chǎn)蛋數(shù)的候選分子遺傳標(biāo)記。