[發明專利]一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法

無效

• 申請號: 201210336227.4
• 申請日: 2012-09-12
• 公開（公告）號: CN102899346A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 劉楠;張洪非;侯宏衛;李中皓;唐綱嶺;陳再根;姜興益;李雪;陳歡;胡清源
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12R1/94
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種煙草花葉病毒殼蛋白模板結構修飾方法，其特征在于：主要通過對His-TMV-CP表達質粒的構建、蛋白的表達及純化的方法進行結構的修飾。

2.根據權利要求1所述的煙草花葉病毒模板結構修飾方法，其特征在于：所述的殼蛋白模板結構修飾方法的具體步驟如下：

1)His-TMV-CP表達質粒的構建

設計上游引物TMVCP?F1，和下游引物His-TMV-CP?R1，兩條引物被用來PCR擴增TMV外殼蛋白，PCR產物隨后經NdeI和NcoI雙酶切，使用T4DNA連接酶連接進入pET28a載體，將連接產物電轉化進入XL1Blue菌株，涂于LB瓊脂平板上；然后挑取潛在的陽性克隆進行擴增，提取質粒DNA，并送測序，在其羧基端含有His標簽的有確定DNA序列的His-TMV-CP質粒,隨后被亞克隆進原核表達菌株Rosetta中進行蛋白表達；

2）His-TMV-CP蛋白的表達

將含有宿主質粒的Rosetta原核表達菌株，置于含有100ug/mL氨芐抗生素和25ug/mL氯霉素的LB培養基中，持續震蕩搖菌直至OD值達到0.5-0.6，在誘導表達前，菌液在25℃條件下孵育4-6分鐘，取1mL菌液，離心，收取細菌保留以備進一步分析；然后加入誘導劑IPTG至濃度達到10μM，而后以SDS-PAGE分離細菌裂解液的方法評估蛋白表達情況,待蛋白表達達到最大值，收取全部菌液，將其重懸于裂解緩沖液中，低溫保存，以備進一步純化蛋白；

3）His-TMV-CP蛋白的純化

將重懸細菌產物在常溫下解凍后，立即加入1.5ml?Buster試劑、30ul?Lysonase試劑、5ml?RNA酶和5ml?DNA酶，在1mM的苯甲基磺酰氟濃度下將上述混合物在30℃，250rpm下震蕩20-40分鐘，加入30mL預冷的平衡緩沖液，冰浴4-6分鐘，以11000-13000g，4℃離心15-20分鐘，取上清與3mL已經平衡緩沖液沖洗的鎳樹脂充分混合，4℃轉動孵育過夜，隨后上蛋白純化柱進行純化；上柱純化時，首先使液體自然流出蛋白純化柱，直至無液體流出，在隨后的純化階段，按照恒定的0.5mL/L的流速洗脫柱子，然后分別以預冷緩沖液、沖洗緩沖液沖洗柱子，最后使用洗脫緩沖液來洗脫目標蛋白，保存于-20℃。

3.根據權利要求1或2的修飾方法，其特征在于：所述的步驟1）中兩條引物分別是：上游引物TMVCP?F1，GATTCGTTTTACATATGTCTTACAGTATVACTAC，和下游引物His-TMV-CP?R1，TAGTACCATGGTCATTAGTGATGGTGATGGTGATGAGTTTGCAGGACCAGAGGTC。

4.根據權利要求1或2的修飾方法，其特征在于：所述的步驟1）中PCR產物擴增的反應條件是：解鏈溫度95℃，30秒，退火溫度55℃，30秒，延伸溫度68℃，30秒，重復35個循環。

5.根據權利要求1或2的修飾方法，其特征在于：所述的步驟3）中預冷緩沖液為50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，1mM?PMSF，10mMβ-巰基乙醇，10mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0；沖洗緩沖液為50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，1mM?PMSF，10mMβ-巰基乙醇，40mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0；洗脫緩沖液為50mM磷酸鉀，300mM氯化鉀，1mM?PMSF，10mMβ-巰基乙醇，500mM咪唑，10%乙醇，PH值8.0。