[發(fā)明專利]用于哈氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增快速檢測試劑盒及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210336013.7
• 申請日: 2012-09-12
• 公開（公告）號: CN102839216A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張曉君;陳麗;畢可然;閆斌倫;秦國民
• 申請（專利權(quán)）人: 淮海工學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種魚類哈氏弧菌的檢測試劑盒，特別是一種用于哈氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增快速檢測試劑盒；本發(fā)明還涉及一種應(yīng)用前述試劑盒進(jìn)行檢測的方法。?

背景技術(shù)

哈氏弧菌是一種具有發(fā)光特性的弧菌，在1936年由Johnson等將其命名為哈氏貝內(nèi)克氏菌（Beneckea??harveyi），1981年Baumann等將其正式歸于弧菌屬并命名為哈氏弧菌(Vibrio?harveyi）。該菌是海水中微生物區(qū)系的正常成員，也是海水中一種常見的致病菌。可引起海水養(yǎng)殖高體鰤、花鱸、斜帶石斑魚、長鰭真鯊、虹鱒和大西洋鮭、齒鯛、金頭鯛、狼鱸、塞內(nèi)加爾鰨、矛尾復(fù)鰕虎魚等多種魚類感染發(fā)病；該菌尤其是對對蝦危害嚴(yán)重，曾引起世界范圍養(yǎng)殖對蝦的大量死亡，有記述該菌引起印度尼西亞、菲律賓及臺灣對蝦育苗場斑節(jié)對蝦和墨吉對蝦幼體的大量死亡。可見哈氏弧菌能夠引起多種海水養(yǎng)殖動物感染發(fā)病，嚴(yán)重制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。該菌傳統(tǒng)的檢驗方法包括形態(tài)學(xué)檢測、生理生化特征檢測等，這些檢測手段不僅工作量大，而且耗時長,?已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上的診斷要求。?

編碼DNA解旋酶B亞單位的基因（gyrB基因）序列具有保守性和變異性，其基因進(jìn)化率較快，堿基替換頻率較高，具設(shè)計PCR引物的保守區(qū)域，是弧菌科種間鑒定及檢測的良好分子靶標(biāo)。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP，1oop-mediated?isothermal?amplification)?是2000?年由Notomi?等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，它具有很高的特異性和靈敏度，且反應(yīng)在恒溫下進(jìn)行，快速簡便，擴(kuò)增產(chǎn)物量大，肉眼、電泳、濁度儀均可進(jìn)行檢測，不需昂貴的儀器。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種新的用于哈氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增快速檢測試劑盒，其靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便，在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物處于帶菌狀態(tài)或大規(guī)模爆發(fā)細(xì)菌性疾病之前能進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測。?

本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供了一種應(yīng)用前述試劑盒進(jìn)行檢測的方法。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種用于哈氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增快速檢測試劑盒,?其特點是，其組成為：?

（1）反應(yīng)液A，1支，其體積百分比組成為：

①10×Lampbuffer，17%；其中Lampbuffer的組成為：200mM?Tris-HCl，100mM?KCl，100mM?(NH₄)₂SO₄，20mM?MgSO₄，質(zhì)量濃度1%的?Trition?X-100，Lampbuffer的pH為?8.8；

②dNTP，16.5%，濃度為10mM；

③硫酸鎂水溶液，14%，濃度為25mM；

④甜菜堿水溶液，26.5%，濃度為8mol/L；

⑤vh-F3，2.5%，濃度為10μM，

上游外部引物vh-F3為：CAA?GAG?CGACCA?CTT?CAT?GT；

⑥vh-B3，2.5%，濃度為10μM，

下游外部引物vh-B3為：TTA?GCG?CTG?CAC?GGA?AAC；

⑦vh-FIP，?10.5%，濃度為10μM，

上游內(nèi)部引物vh-FIP為：TCG?CGC?TCA?AAG?TCG?AAG?TGG-CAA?GCG?TTT?GTT?GAG?CAC?C；

⑧vh-BIP?，10.5%，濃度為10μM，

下游內(nèi)部引物vh-BIP為：TCT?CGG?TAG?AAG?TGG?CGA?TGC?A-TCG?CGT?TGT?GGG?ATG?TTG；

（2）反應(yīng)液B：8000U?的Bst?DNA酶，1支；

（3）反應(yīng)液C：10×熒光染料SYBR?GreenⅠ，1支；

（4）哈氏弧菌基因組DNA的陽性對照試樣，1支；

（5）健康魚組織總DNA的陰性對照試樣，1支；

（6）超純水，1支。

本發(fā)明還提供了一種哈氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增快速檢測方法，其特點是，該方法應(yīng)用了以上技術(shù)方案所述的試劑盒；其步驟如下：?

（1）DNA抽提：取1mL待檢樣品增菌液12000?r/min離心1min，棄上清，將菌體懸浮于100μL的滅菌蒸餾水中，100℃煮沸10min，冰浴中冷卻后12000?r/min離心10min，取上清作為PCR模板DNA；