[發明專利]一種木聚糖酶基因及表達蛋白和應用

無效

• 申請號: 201210333742.7
• 申請日: 2012-09-11
• 公開（公告）號: CN102864160A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 王飛;時號;李迅;仲惠
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/11;C12P19/14
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 邱興天

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種木聚糖酶基因及其表達蛋白和應用。

背景技術

半纖維素是植物細胞壁的主要成分，是除纖維素之外自然界中最為豐富的可再生資源。半纖維素一般由木聚糖即以β-D-1,4木糖苷鍵連接起來的一種多聚五碳糖為主鏈，并帶有多種取代基，如阿拉伯糖基，α-葡萄糖醛酸基等。木聚糖徹底降解則得到木糖、阿魏糖、阿拉伯糖等，其中以木糖為主。木聚糖酶是木聚糖降解酶系中的最為關鍵的多糖水解酶，通過隨機切割木聚糖的β-1,4-糖苷鍵，將木聚糖水解為木寡糖、低聚木糖及少量的木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶在造紙紙漿、釀造及飼料工業等方面已體現顯著的應用價值，因此可作為一種高效的工業酶制劑應用于上述幾個方面。耐熱纖維水解酶包括木聚糖酶及葡聚糖酶的開發利用是當今纖維類生物質精煉技術領域的重要發展方向。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種木聚糖酶基因。本發明的另一目的是提供一種上述木聚糖酶基因表達的適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶。本發明還有一目的是提供上述一種木聚糖酶的應用。

技術方案：為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種木聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ?NO：1所示。

一種木聚糖酶基因的表達蛋白，為適合中溫下半纖維素水解的木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ?NO：2所示。

一種木聚糖酶基因的表達蛋白，氨基酸序列為SEQ?NO：2序列中的氨基酸經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失及添加形成的具有木聚糖酶活性的衍生蛋白質。

一種重組載體，在所述的重組載體上克隆有如SEQ?NO：1所示的DNA序列。

一種重組菌，在所述的重組菌內克隆有如SEQ?NO：1所示的DNA序列。

一種用于擴增木聚糖酶基因的引物，所使用的引物對為：

Tth-1：5’-GGAATTCCATATGGGACCACAGCCCATGTCGTC-3’；

Tth-2：5’-CCGCTCGAGCTTGGAAACTGATTCTATTACACTC-3’。

上述的木聚糖酶在酶解木聚糖中的應用。酶解反應溫度為60-80℃，pH5.5-6.5。所述的木聚糖來源于纖維原料中的半纖維素，包括櫸木木聚糖、樺木木聚糖和燕麥木聚糖。

上述的重組載體或重組菌在酶解木聚糖中的應用。

有益效果：與現有技術相比，本發明所提供的木聚糖酶具有較好的的耐熱性能和略偏酸性pH條件下高活性的特性。在80℃、pH為6.0的條件下酶活性最高，比酶活達到35?U/mg；該蛋白酶在溫度為60℃-80℃、pH為5.5-65的范圍內，均具有較高的酶活。該木聚糖酶的耐熱性能較高，在65℃，pH6.0的反應體系中，保溫2h?酶活性基本保持不變。上述特性使得本發明得到的木聚糖酶比現有木聚糖酶具有更大的優越性，適用于65℃以上高溫、略偏酸性pH條件下半纖維素的降解，具有潛在的工業應用價值。

附圖說明

圖1是Tth?xyn10B蛋白的SDS-PAGE圖；

圖2是Tth?xyn10B蛋白的最適溫度結果圖；

圖3是Tth?xyn10B蛋白的最適pH結果圖；

圖4是Tth?xyn10B蛋白的熱穩定性結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。

以下實施例中所使用的材料、試劑等，若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

實施例1?嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌基因組DNA的提取

采用嗜熱陸地熱泉高溫神袍菌Thermotoga?thermarum?DSM5069（購自德國微生物菌種保藏中心）新鮮菌體10g，懸于5mL?50mM?Tris緩沖溶液中（pH8.0），混勻后在37℃放置20min，然后加入2mL?10%SDS，55℃放置5min，用等體積的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清液加入2倍體積的無水乙醇，于-20℃放置30min，4℃?13000rpm離心20min，收集沉淀。沉淀溶于0.5mL?TE緩沖液（pH8.0，10mM?Tris，1mM?EDTA），加入10mg/mL?RNase?3μL，37℃保溫1?h，用等體積的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清加入2倍體積的無水乙醇，于-20℃放置30min，4℃?13000rpm離心20min，收集沉淀，真空冷凍干燥，用0.5mL超純水溶解。

實施例2?木聚糖酶基因Tth?xyn10B的制備