[發明專利]重組融合蛋白PTD-HSP27及其應用

無效

• 申請號: 201210333563.3
• 申請日: 2012-09-11
• 公開（公告）號: CN102827291A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 鐘敬祥;余榕捷;劉蓮;戴云;施月歡
• 申請（專利權）人: 鐘敬祥
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;A61K38/17;A61K47/48;A61P27/12
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 倪小敏

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體設計及重組融合蛋白技術領域，尤其涉及一種重組融合蛋白PTD-HSP27及其應用。

背景技術

白內障是發生在眼球內晶狀體上的一種疾病，是最常見的致盲和視力殘疾的原因。分析探討白內障的發展過程和發病機制，開發出有效的預防和治療白內障的藥物具有重要的社會效益。已有研究證實細胞凋亡在空間和時間上要早于白內障的發生，推斷晶狀體上皮細胞凋亡可能是各種白內障發生的共同細胞學基礎。細胞凋亡機制認為如果上皮細胞出現凋亡，晶狀體生長就會停滯，晶狀體上皮細胞（LEC）出現脫落，從而導致細胞膜通透性增加等一系列改變，晶狀體穩定性受到破壞，最終導致白內障的發生。

熱休克蛋白是生物體或離體培養細胞在不良環境因素作用下所產生的一組具有高度保守性的應激蛋白，在細胞保護中具有重要的作用。熱休克蛋白27（Heat?Shock?Protein?27，HSP27），是HSP家族中sHSP亞家族中的一員，可以與部分展開或與非天然的蛋白質結合，能夠抑制細胞的凋亡，保護組織細胞免受進一步的變性。大量的研究證實小分子的HSP27可通過抑制線粒體釋放細胞色素C以及直接與細胞色素C、Caspase-3前體結合而抑制細胞凋亡。研究發現，轉基因小鼠的心肌出現缺血再灌注損傷時，心肌細胞大量表達HSP27防止細胞發生凋亡和壞死。由此可以推測細胞內HSP27含量的增加可以抑制細胞的凋亡。

PTD（Protein?transduction?domain）是最初發現于HIV病毒TAT?蛋白中的具有穿膜功能的核心區；由11個氨基酸YGRKKRRQRRR組成，含有8個堿性氨基酸，生理條件下帶較高的正電荷，并形成穩定的α螺旋結構。PTD具有強大的運載潛能，能將外源性蛋白質、DNA、RNA、化學藥物等轉運至細胞內，甚至可以穿越血腦屏障。此過程不受化合物／復合物分子類型和大小的限制，并且對宿主細胞沒有顯著毒副作用。

一般情況下，HSP27只能通過細胞應激狀態下的自行產生而發揮其分子伴侶等功用。本發明利用基因工程原理和技術實現重組的HSP27和PTD融合的新型融合蛋白PTD-HSP27的制備，首次將其應用于人眼晶狀體上皮細胞，對其生物學功能進行研究。并證實PTD-HSP27既有HSP27的功能活性，又能跨細胞屏障運輸，穿過角膜各層細胞進入眼內。此項特性使PTD-HSP27可通過房水循環作用于眼內各類細胞，這一特點使其用藥途徑獲得優化，應用范圍得以擴展。

目前尚未有人利用PTD的運載功能將HSP27運送進入眼內，利用PTD-HSP27作用于眼部的各類細胞，從而實現例如延緩白內障等眼部疾病的發生發展，未見有相關報道。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種既可通過角膜屏障和跨膜運輸，又具備HSP27生物活性的重組融合蛋白PTD-HSP27。

本發明的另一個目的是提供上述重組融合蛋白PTD-HSP27在制備預防和治療細胞凋亡相關眼部疾病的藥物中的應用。

本發明的上述目的通過如下方案予以實現：

本發明的重組融合蛋白PTD-HSP27，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。

一種編碼上述重組蛋白PTD-HSP27的基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2。

本發明的重組蛋白PTD-HSP27能用于預防或治療細胞凋亡相關眼部疾病，特別是PTD-HSP27可較易穿過角膜的細胞屏障，跨膜運輸進入晶狀體上皮細胞，抑制晶狀體上皮細胞的凋亡，極大的緩解白內障的發生和發展。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

1.細胞水平研究發現，本發明的重組融合蛋白PTD-HSP27具有減少人晶狀體上皮細胞凋亡的功能，說明PTD-HSP27具有HSP27的活性。

2.?本發明中PTD-HSP27既具有HSP27的生物學活性，又因含有PTD而具備跨生物屏障運輸的功能，能有效穿過角膜組織進入房水，從而可對眼內各類細胞發揮功用。

3.本發明中應用的重組融合蛋白PTD-HSP27為穿角膜施藥等方面都提供了研究基礎，而且鑒于該重組融合蛋白PTD-HSP27既有HSP27的活性，又能跨角膜運輸，可改善其用藥途徑及擴大其應用范圍。

附圖說明

圖1重組融合蛋白PTD-HSP27電泳圖。

圖2為重組融合蛋白PTD-HSP27穿LEC細胞膜進入細胞；A為相差顯微鏡下的LEC細胞，B為熒光顯微鏡下的標記蛋白PTD-HSP27的熒光分布，C為圖A、B疊加，顯示為PTD-HSP27蛋白位于LEC細胞內，提示PTD-HSP27可進入LEC細胞。