[發明專利]用于實時PCR多重分析的系統和方法

有效

• 申請號: 201210331061.7
• 申請日: 2007-12-13
• 公開（公告）號: CN102851369A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 道格拉斯·F·惠特曼;查爾斯·J·柯林斯
• 申請（專利權）人: 盧米耐克斯公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 顧晉偉;田旸

1.一種定量樣品中核酸靶標的量的方法，該方法包括：

(a)在腔室中合并含有所述核酸靶標的樣品、用于引發所述核酸靶標擴增的引物對、標記試劑以及與所述核酸靶標互補的探針，其中所述探針固定于磁珠上；

(b)進行擴增循環，以形成用所述引物對擴增的所述核酸靶標的擴增產物；

(c)將所述擴增產物與所述探針組進行雜交；

(d)向所述腔室表面施加磁場，用以將所述磁珠、與固定于該磁珠上之探針雜交的所述擴增產物以及與所述擴增產物締合的任何標記試劑吸引至所述腔室表面；

(e)檢測來自所述標記試劑的信號；

(f)從所述腔室表面撤走磁場，之后進行下一擴增循環；

(g)重復步驟(b)至(f)至少直到所述信號能區別于背景噪聲；以及

(h)通過將所述信號與所述樣品中核酸靶標的量建立關聯來定量該樣品中核酸靶標的量。

2.權利要求1的方法，其中定量所述樣品中核酸靶標的量包括確定所述核酸靶標的絕對量。

3.權利要求1的方法，其中定量所述樣品中核酸靶標的量包括確定所述核酸靶標的相對量。

4.權利要求1的方法，其中將所述信號與所述樣品中核酸靶標的量建立關聯包括：

(a)將所述信號對擴增循環數作圖；以及

(b)將所述信號對擴增循環數的圖與標準曲線進行比較，該標準曲線通過已知量之所述核酸靶標的連續稀釋的實時PCR得到。

5.權利要求1的方法，其中所述信號是熒光信號。

6.權利要求5的方法，其還包括測定來自多個所述磁珠的熒光信號的中值熒光強度(MFI)。

7.權利要求6的方法，其包括測定來自約100個所述磁珠的熒光信號的MFI。

8.權利要求1的方法，其中所述磁珠是經編碼磁珠。

9.權利要求8的方法，其中所述經編碼磁珠用具有不同發射波長或不同熒光強度或兼具二者的熒光染料進行編碼。

10.權利要求8的方法，其還包括檢測來自經所述熒光染料編碼之磁珠的熒光信號。

11.權利要求8的方法，其還包括在所述腔室中合并陰性對照磁珠。

12.權利要求11的方法，其還包括測定來自多個所述經編碼磁珠的熒光信號的中值熒光強度(MFI)；以及測定來自多個所述陰性對照珠的熒光信號的中值熒光強度(MFI)。

13.權利要求12的方法，其進一步從所述經編碼磁珠的MFI減去所述陰性對照珠的MFI。

14.權利要求1的方法，其中所述磁珠是超順磁性的。

15.權利要求1的方法，其中步驟(b)至(f)被重復10～40次。

16.權利要求1的方法，其中所述探針包含經封閉的3’羥基。

17.權利要求1的方法，其中所述標記試劑與固定于所述磁珠上的所述探針結合。

18.權利要求17的方法，其中所述探針是分子信標探針。

19.權利要求1的方法，其中所述標記試劑與互補于所述核酸靶標的第二探針結合，其中所述第二探針不固定在所述磁珠上，并且其中所述第二探針和所述經固定探針與所述核酸靶標上的不同區域互補。

20.權利要求1的方法，其中所述標記試劑與所述引物對中的一種引物結合。

21.權利要求1的方法，其中所述標記試劑是熒光團。

22.權利要求1的方法，其中所述標記試劑是成對的熒光團和猝滅劑。

23.權利要求1的方法，其中所述標記試劑是熒光共振能轉移對。

24.權利要求1的方法，其中所述標記試劑是DNA嵌入劑。

25.權利要求1的方法，其中所述樣品包含多種核酸靶標。