[發明專利]膜蛋白分析鑒定用樣品的處理方法

有效

• 申請號: 201210328982.8
• 申請日: 2012-09-07
• 公開（公告）號: CN102854272A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發明（設計）人: 王賢純;梁宋平;林勇
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06
• 代理公司: 長沙永星專利商標事務所 43001
• 代理人: 周詠;米中業

技術領域

本發明涉及膜蛋白質組學研究領域，具體涉及一種膜蛋白分析鑒定用樣品的處理方法。

背景技術

膜蛋白質組學研究中，大多數膜蛋白尤其是整合膜蛋白由于疏水性強，妨礙了它們的有效提取、溶解和酶解，從而影響了它們的分析鑒定。為了增加膜蛋白的溶解性，對膜蛋白分析鑒定用樣品的處理通常采用往緩沖液中添加促溶劑（如去垢劑、有機溶劑和變性劑等）的方法。與其他種類的促溶劑相比，去垢劑由于促溶能力較強而應用較多。用去垢劑提取膜蛋白時，去垢劑的使用濃度一般為1-2%。其中，十二烷基硫酸鈉（SDS）能有效裂解生物膜、提取膜蛋白，被認為是目前已知的提取膜蛋白能力最強的去垢劑。采用SDS處理膜蛋白分析鑒定用樣品時，一般是將已經過富集純化的膜片溶于含2%左右?SDS的水溶液，離心后取上清液作為樣品，再將樣品中SDS的濃度稀釋至不高于0.1%后進行液相酶解，酶解肽段用于液相色譜-質譜聯用分析；或將含SDS的樣品包埋入凝膠，然后反復洗滌膠塊以去除其中的SDS，使SDS濃度降低至不高于0.1%，然后進行膠內酶解，酶解肽段采用液相色譜-質譜聯用分析；或用離子交換的方法使SDS濃度降低至不高于0.1%，再進行酶解及液相色譜-質譜聯用分析。此方法可用于膜蛋白分析鑒定用樣品的處理，但由于樣品中SDS濃度高于0.1%即嚴重抑制蛋白酶活性，因此在蛋白質酶解前須將樣品中SDS濃度降低至不高于0.1%，常用稀釋、凝膠介導樣品凈化或離子交換等方法降低樣品中SDS濃度，但大幅度的稀釋會使樣品體積大大增加，從而增加酶解時酶的用量；且樣品中的SDS?并未徹底去除，樣品體積過大也給后續分析鑒定帶來困難；采用凝膠介導的樣品凈化方法或離子交換等其余方法，操作相對麻煩且易造成樣品損失。由于SDS的存在會影響后續的蛋白質酶解和液相色譜-質譜聯用分析,?從而限制了它在膜蛋白分析鑒定用樣品處理中的應用。脫氧膽酸鈉（SDC）和一種商品化的酸不穩定去垢劑ALS（sodium?3–[(2–methyl–2–undecyl–1,3–dioxolan–4–yl)?methoxyl]?–1–propanesulfonate，商品名為RapiGest?SF，文獻一般以ALS或RapiGest?SF稱之，沒有中文名稱）是與SDS具有類似作用的去垢劑，它們可以在較高的濃度下使用而不影響蛋白酶的活性；且由于可在酸性條件下析出而易于從樣品中除去，不會干擾后續的質譜分析；其不足之處是它們溶解生物膜、提取膜蛋白的能力不如SDS。鑒于目前使用的促溶劑要么提取膜蛋白的能力不強，要么會干擾后續分析鑒定，難以取得好的效果。因此，開發適宜的膜蛋白分析鑒定用樣品的處理方法，對于膜蛋白質組學研究具有十分重要的意義。

發明內容

本發明針對上述不足，提供一種步驟簡單、分析鑒定效果更好的膜蛋白分析鑒定用樣品的處理方法。

本發明提供的膜蛋白分析鑒定用樣品的處理方法，依次包含以下步驟：

（1）用質量百分含量為1.0%的月桂酸鈉（SL）溶液裂解經富集純化的生物膜，提取膜蛋白，離心取上清液，得到蛋白質樣品；

（2）將步驟（1）得到的蛋白質樣品用緩沖液稀釋至SL的質量百分含量為0.1%后，經酶解、酸化，萃取去除酸化后析出的月桂酸，再經冷凍真空干燥得分析用樣品，分析用樣品用于液相色譜-串聯質譜聯用分析鑒定。