[發明專利]一種誘導短壽抗體反應的血吸蟲抗原和檢測該抗體反應的血吸蟲病診斷試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201210328791.1
• 申請日: 2012-09-06
• 公開（公告）號: CN103667200A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 余傳信;王玠;殷旭仁;華萬全
• 申請（專利權）人: 江蘇省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/63;G01N33/573;G01N33/543
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種在血吸蟲感染人或家兔體內誘導抗原依賴的特異性短壽抗體反應的日本血吸蟲三磷酸甘油醛脫氫酶Sj?GAPDH蛋白，其編碼基因的核苷酸序列與SEQ?ID?NO.1的同源性在90%以上，其蛋白質氨基酸與SEQ?ID?NO.2的同源性保持在90%以上。

2.一種重組Sj?GAPDH蛋白的構建方法，其特征在于：

（1）日本血吸蟲三磷酸甘油醛脫氫酶Sj?GAPDH編碼基因的制備

根據已發表的Sj?GAPDH基因SEQ?ID?NO.1的核苷酸序列，設計一對引物：

Sj?GAPDH1：5’-ATGCTAGCATGTCGAAGGCTAAGGTTGGTATCAAT-3’，含有Nhe1酶切位點；

Sj?GAPDH2：5’-AAGAGCTCTTAAGAATGGTCGACTCTATGC-3’，含有Sac1酶切位點；

采用RT-PCR方法從日本血吸蟲成蟲cDNA中擴增出Sj?GAPDH的編碼區基因片段；將Sj?GAPDH基因片段插入到TA克隆載體pGEM-T中構建成功含Sj?GAPDH基因序列的重組質粒Sj?GAPDH/pGEM-T；

編碼Sj?GAPDH的基因序列與核甘酸序列SEQ?ID?NO：1保持90%以上的同源性；

（2）體外表達Sj?GAPDH蛋白的重組表達質粒Sj?GAPDH-pET28a的構建

用限制性內切酶Nhe1和Sac1對重組質粒Sj?GAPDH/pGEM-T進行限制性酶切，經1%的瓊脂糖凝膠電泳，回收5’端帶有Nhe1、3’端帶Sac1酶切位點的Sj?GAPDH基因片段；同法對表達質粒pET28a(+)進行限制性酶切制備5’端帶有Nhe1、3’端帶Sac1酶切位點的線性化pET28a(+)質粒；將Sj?GAPDH基因片段與線性化質粒pET28a(+)按1︰3的比例混合，用T4?DNA連接酶連接構成重組表達質粒Sj?GAPDH/pET28a；但Sj?GAPDH蛋白表達還可以采用除pET28a(+)以外的其它原核、真核表達質粒進行表達，本發明優選的質粒是pET28a(+)；

（3）將重組表達質粒Sj?GAPDH-pET28a轉化到大腸桿菌BL21中，通過卡那霉素篩選含有重組表達質粒Sj?GAPDH-pET28a的工程菌落；重組Sj?GAPDH-pET28a可以采用除大腸桿菌BL21以外的其它受體菌進行表達，本發明優選的受體菌是大腸桿菌BL21；

（4）大量表達與純化重組Sj?GAPDH蛋白

將含有重組表達質粒Sj?GAPDH-pET28a的表達工程菌接種到含卡那霉素的LB液體培養基中，37℃培養過夜，第二天轉種到大體積的LB液體培養基中，37℃培養4小時，然后加入終濃度為1mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG進行蛋白質表達誘導；表達細菌的沉淀物用于表達分析與純化；

將表達產物上清液過鎳離子親和層析柱，通過親和層析的方法制備純化的重組Sj?GAPDH蛋白。