[發(fā)明專利]一種用于改良硅藻產(chǎn)油遺傳特征的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210326390.2
• 申請(qǐng)日: 2012-09-06
• 公開（公告）號(hào): CN102827856A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孔任秋;徐旭東;劉飛飛;方仙桃
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院水生生物研究所;中國石油化工股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N1/13;C12R1/89
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 黃瑞棠

1.一種用于改良硅藻產(chǎn)油遺傳特征的方法，其特征在于：

本方法包括下列步驟：

①構(gòu)建核基因轉(zhuǎn)化質(zhì)粒

????該質(zhì)粒可在T載體中克隆一個(gè)合適的外源抗性基因，由硅藻本身基因的啟動(dòng)子和終止子或其它真核生物的啟動(dòng)子和終止子，驅(qū)動(dòng)表達(dá)和終止；

②將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入硅藻核基因組中構(gòu)建隨機(jī)插入突變體庫

????利用基因槍法將所構(gòu)建質(zhì)粒對(duì)所要改造的硅藻進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在抗性平板上進(jìn)行選擇，待轉(zhuǎn)化子達(dá)到5000個(gè)以上的克隆組成一個(gè)插入突變體庫；突變體庫用PCR和DNA印跡雜交方法檢測(cè)外源基因的插入率和插入拷貝數(shù)，插入率達(dá)到95%以上，插入拷貝證明是一個(gè)或多個(gè)拷貝即可開始篩選目標(biāo)突變體；

③以尼羅紅熒光染色比值法對(duì)突變體庫進(jìn)行篩選高產(chǎn)油突變株

在24孔板中將抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行液體培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入96孔板中批量進(jìn)行尼羅紅染色，測(cè)定中性脂熒光，再以同樣數(shù)量藻樣檢測(cè)葉綠體熒光；根據(jù)我們的研究表明，在一定細(xì)胞密度范圍內(nèi)，中性脂熒光和葉綠體熒光比值的高低，可以顯示不同藻株單位生物量的相對(duì)含油量，通過與野生型比較，選出熒光比值顯著高于野生型的藻株初步定為高產(chǎn)油株，比值低于野生型的為低產(chǎn)油株；

④細(xì)胞中甘油三酯測(cè)定和脂肪酸分析

????對(duì)所選產(chǎn)油突變株以稱重法分析總脂和甘油三酯含量；一般將藻株培養(yǎng)至穩(wěn)衡期，離心收集冷凍干燥后取100mg干藻粉，首先以有機(jī)溶劑萃取法提取總脂，確定總脂占干重的百分含量后，從總脂中以薄層層析法分離甘油三酯，再確定甘油三酯占干重的百分含量；以氣象色譜法分析甘油三酯的脂肪酸組成，所有結(jié)果均有野生型對(duì)照比較；

⑤生長測(cè)定

????對(duì)所選高產(chǎn)油株在常規(guī)光照條件下培養(yǎng)，同時(shí)加上野生型對(duì)照，每株藻設(shè)三個(gè)平行，每天或每隔一天測(cè)定一次細(xì)胞的光密度值，制作生長曲線，比較它們與野生型的生長情況，最后選出具有比野生型甘油三酯含量高，生長又不受到限制和影響的藻株。

2.按權(quán)利要求1所述的一種用于改良硅藻產(chǎn)油遺傳特征的方法，其特征在于三角褐指藻：引物-1、引物-2、引物-5和引物-6；以及利用該方法篩選硅藻突變株的過程。