[發明專利]一種膝溝藻毒素GTX2,3人工抗原制備的新方法

有效

• 申請號: 201210325168.0
• 申請日: 2012-09-05
• 公開（公告）號: CN102807616A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 張銳;章超樺;秦小明
• 申請（專利權）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/795
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

1.一種膝溝藻毒素GTX2,3人工抗原制備的新方法，其特征在于：該方法是利用膝溝藻毒素GTX_2,3與載體蛋白BSA及KLH大分子偶聯制備人工抗原的方法，用乙二醛在半抗原分子GTX_2,3第2號和8號位亞氨位上引進2個自由的氨基，再用2步法將此中間產物(?H₂N-?GTX2,3)?分別與載體蛋白BSA?和KLH?偶聯.具體方法如下：

(1)??均取85μL?的2.37mg.mL^-1?GTX2,3毒素原液在避光下加入少量0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸鈉溶液，輕彈混勻，使得溶液的pH值為4.6；

(2)?向(1)溶液中分別加入適量新鮮配制的乙二醛，?使醛的終濃度為0.1～3%；

(3)?稱取0.0023?g?BSA、0.0023?g?KLH?分別溶于160?μL?0.01?mol·L^-1?pH7.6的PBS?中，?分別加入上述（2）溶液中；使GTX：BSA的摩爾比為3～20，GTX：KLH的摩爾比為5～25；

（4）25℃反應20～80h后轉入4℃冰箱反應10～30?h，即先將GTX2,3活化；

(5)?將反應溶液轉移到截留分子量為5000Da的超濾管，并記下溶液的體積，3000～8000rpm離心5～20min；或者將反應溶液轉移到截留分子量為5000Da的透析袋中，4℃透析過夜；

(6)?收集超濾外液，并向超濾管中加入適當體積的0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸鈉溶液，使得溶液的pH值為4.6，重復離心2～3次，超濾離心除去未反應的毒素、醛類小分子；

(7)?超濾3?次后取超濾外液0.5?mL?注射小鼠，5?min?后小鼠死亡；

(8)?繼續超濾離心：重復超濾離心5?次后，取超濾截留物及超濾外液分別注射小鼠，未見死亡；

(9)?將超濾管倒轉離心，3000～8000rpm離心5min，收集管內容物，分裝，?20℃保存，得到GTX2,3-BSA和GTX2,3-KLH；

(10)得到的產物用MiliiPore?超濾裝置過濾后，冷凍干燥即得到的蛋白質抗原。

2.根據權利要求1所述的一種膝溝藻毒素GTX2,3人工抗原制備的新方法，其特征在于：GTX_2,3先與終濃度為0.1～3%的乙二醛結合，再與載體蛋白BSA和KLH偶聯。

3.根據權利要求1所述的一種膝溝藻毒素GTX2,3人工抗原制備的新方法，其特征在于：膝溝藻毒素GTX2,3與載體蛋白的摩爾質量比為1∶3～25。

4.根據權利要求1或2所述的一種膝溝藻毒素GTX2,3人工抗原制備的新方法，其特征在于：膝溝藻毒素GTX_2,3毒素與載體蛋白的摩爾質量比為1∶15。