[發(fā)明專利]一種硨磲科貝類線粒體COI基因擴增引物

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210324790.X
• 申請日: 2012-09-01
• 公開（公告）號: CN102816762A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設計）人: 于貞貞;李琪;孔令鋒
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及一種硨磲科貝類線粒體COI[the?cytochrome?c?oxidase?I]基因擴增引物。

背景技術

硨磲科(Corbiculacea)隸屬于雙殼綱(Bivalvia)，異齒亞綱(Heterodonta)，簾蛤目(Veneroida)，它是世界上最大的雙殼貝類，多分布于印度洋和太平洋海域，特別是在印度尼西亞、馬來西亞和澳大利亞等熱帶海域低潮區(qū)附近的珊瑚礁間較多，我國的海南省以及南海諸島也有分布。全世界共有2屬6種，其中大硨磲、庫氏硨磲和鱗硨磲被列為世界珍稀保護動物。硨磲科物種自古以來受到人們的青睞，位于“佛教七寶”之首。而且硨磲肉質鮮美，營養(yǎng)豐富，是名貴的海產品，并具有一定的藥用價值和觀賞價值。由于其生活環(huán)境的特殊性，還可以成為評價珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)是否健康的重要指標。硨磲將是一種非常有養(yǎng)殖前景的海洋經(jīng)濟貝類。然而由于硨磲科的貝殼外部形態(tài)可塑性強、受環(huán)境影響大，有時還覆蓋有大量附著物，利用形態(tài)特征對硨磲科進行物種分類和系統(tǒng)發(fā)育的分析變得異常困難，特別對于一些近緣物種，單利用形態(tài)特征很難區(qū)分開來。

近年來，利用分子技術對物種進行分類和系統(tǒng)發(fā)育分析已成為一種有效的方法，其中線粒體COI基因已成為區(qū)分物種和研究物種進化關系的理想標記，并在許多物種中得到了成功應用。因此，利用mtCOI基因對硨磲科進行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析具有很好的前景。

然而貝類mtCOI序列的變異速率明顯高于動物的其他類群，軟體動物不同物種，即使是近緣種甚至種內不同群體之間的mtCOI序列變異都很大，這就導致了Folmer等人于1994年設計的COI通用引物LC01490和HCO2198在這一動物類群中的擴增效率極低。缺少擴增效率高的引物已經(jīng)嚴重阻礙了這種分子標記應用于雙殼貝類的分子鑒定研究。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的是提供一種硨磲科貝類線粒體COI基因適用性好的擴增引物，它能滿足現(xiàn)有技術的上述需求。

本發(fā)明根據(jù)硨磲科物種COI基因序列變異度較高和非特異性擴增引物擴增效率低的特性，對比分析美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已有的硨磲科貝類序列，結合自己利用通用引物擴增的序列，通過重復試驗，最終篩選出硨磲科貝類COI基因最適擴增引物。采用本發(fā)明的硨磲科貝類COI基因擴增引物，可以高效的擴增出硨磲科不同物種的COI序列，更有利于硨磲科的物種遺傳多樣性的研究。

具體實施方式

本發(fā)明的硨磲科貝類線粒體COI基因擴增引物的篩選方法采用四個步驟：a、在美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載已有的硨磲科序列；b、利用COI通用擴增引物(LCO1490F和HCO2198R，F(xiàn)olmer?1994)擴增出部分硨磲科物種的COI序列；c、從上述得到的硨磲科mtCOI序列中，通過比對找出保守的序列片段，合成多套擴增引物序列；d、從合成的多套擴增引物序列中篩選出擴增硨磲科線粒體COI基因效果最好的一對引物。

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明：

1.在美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下載已有的5種硨磲科貝類52條COI序列：番紅硨磲(Genbank?Number：JN392040-JN392066)；大硨磲(Genbank?Number：EU003616)；無鱗硨磲(Genbank?Number：GQ166591)；鱗硨磲(Genbank?Number：JN392020-JN392037)；長硨磲：(Genbank?Number：EU003610-EU003614)。

2.樣品采集：于2002年～2011年，從中國南北沿海共采集硨磲科2個屬4個種類的43個個體。

3.DNA提取：用苯酚-氯仿法對所采集樣品進行DNA提取。

4.COI通用擴增引物擴增：利用Folmer于1994年設計的COI通用擴增引物

LCO1490F：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’

HCO2198R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’