[發明專利]一種鴨黃病毒檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201210323150.7
• 申請日: 2012-09-04
• 公開（公告）號: CN102839225A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 陸新浩;廖敏;陳秋英;劉鴻;朱夢代;吳勇;周繼勇;任祖伊
• 申請（專利權）人: 余姚市禽畜病防治研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 余姚德盛專利代理事務所(普通合伙) 33239
• 代理人: 胡小永

1.一種鴨黃病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

i、RNA提取試劑，包括Trizol試劑、氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC水；

ii、反轉錄PCR試劑，包括反轉錄反應試劑和PCR反應試劑；

所述反轉錄反應試劑包括0.2μg/μl的Random?primer、DEPC水、5×buffer、10mM的dNTP、20u/μl的Rnase抑制劑、200u/μl的M-MuLV以及樣品總RNA；

所述PCR反應試劑包括20u/μl的ExTaq酶、10mM的鴨黃病毒通用上游引物DFV-F、10mM的鴨黃病毒通用下游引物DFV-R，2.5mM的dNTP、10×buffer；

所述鴨黃病毒通用上游引物DFV-F為5′-AATTCGACACATGAGATGTAC-3′；

所述鴨黃病毒通用下游引物DFV-R為5′-CCAAGCCACATGTACCA-3′；

iii、鴨黃病毒鴨胚尿囊毒陽性對照和陰性樣品。

2.根據權利要求1所述的鴨黃病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應試劑擴增獲得的PCR產物為SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。

3.根據權利要求1所述的鴨黃病毒檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應試劑擴增獲得的PCR產物為與SEQ?ID?NO:1所示同源性在99%以上的核苷酸序列。

4.權利要求1所述的鴨黃病毒檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，其步驟包括：

第一步，從待測鴨胚尿囊液樣品中提取總RNA，其提取方法是：1.5mlEP管中加0.2ml待測鴨胚尿囊液樣品后，加入0.8ml?Trizol試劑，混勻，室溫靜置10-30min；加0.2ml氯仿，振蕩混勻15s，室溫靜置10-15min；4℃，12000g離心15min；取水層，加等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10min；4℃，12000g離心10min；棄去上清，加1ml?75%乙醇，4℃，7500g離心5min；棄去上清，沉淀干燥5-10min，加20μl?DEPC水溶解，得總RNA；

第二步，以所述第一步提取的總RNA為模板，進行反轉錄反應，反轉錄反應的步驟為：1μg總RNA加1μl?Random?primer加DEPC水至12μl，65℃冰浴5min；再加4μl?5×buffer、2μl?10mM?dNTP、1μl?RNase抑制劑、1μl?M-MuLV、混勻，25℃5min，42℃1h，70℃5min，得反轉錄產物；

第三步，以所述反轉錄產物為模板，進行PCR擴增，所述PCR體系為：ExTaq酶0.25μl，10mM的引物DFV-F和10mM的引物DFV-R各2μl，2.5mM的dNTP?4μl，10×buffer?5μl，模板2.5μl，加水至50μl；所述PCR反應體系的反應條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸50s，30個循環，72℃延伸10min；

第四步，取所述第三步PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后判斷結果。

5.根據權利要求2所述的鴨黃病毒檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，擴增獲得的PCR產物為SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。

6.根據權利要求2所述的鴨黃病毒檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，擴增獲得的PCR產物為與SEQ?ID?NO:1所示同源性在99%以上的核苷酸序列。