[發(fā)明專利]一種高偶聯(lián)率高活性重金屬全抗原的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210322831.1
• 申請日: 2012-09-04
• 公開（公告）號: CN102875668A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅舜菁;劉成梅;王文飛;鄒常春;萬婕;鐘業(yè)俊
• 申請（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K14/47;C07K1/113
• 代理公司: 南昌市平凡知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 36122
• 代理人: 夏材祥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高偶聯(lián)率、高活性重金屬全抗原的制備方法，屬于免疫化學(xué)及殘留分析生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

重金屬是指比重大于?5?g·cm^-3的金屬元素，在自然界中大約存在?45?種。但是，由于不同的重金屬毒性差別很大，所以在環(huán)境科學(xué)中人們通常關(guān)注?Hg、Cd、Pb、Cr、Cu、Co?、Ni等。在天然水體中只要有微量重金屬即可產(chǎn)生毒性效應(yīng)，重金屬是一類具有積蓄性的對環(huán)境永久有害的物質(zhì)，且不能通過化學(xué)或生物修復(fù)過程轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害物質(zhì)。生物從環(huán)境中攝取重金屬可以經(jīng)過食物鏈的生物放大作用，在較高級生物體內(nèi)成千萬倍地富集起來，然后通過食物進入人體，在人體的某些器官中積蓄起來造成慢性中毒，危害人體健康。被重金屬污染的地區(qū)，必須進行定期檢測。

目前,國內(nèi)重金屬污染檢測主要采用理化分析方法,包括紫外分光光度法UV、石墨爐原子吸收光譜法GFAA?S、火焰原子吸收光譜法?FAAS、電感耦合等離子體質(zhì)譜法ICP-MS、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法ICP-AES等,但這些方法均存在需要昂貴的儀器設(shè)備、熟練的專業(yè)人員、煩瑣費時、周期長、費用高、不能現(xiàn)場操作、樣品篩檢量小等缺陷。重金屬離子免疫學(xué)檢測方法是一種新型的分析方法,?具有省時省力、費用低廉、便于攜帶、操作簡便、高靈敏度和特異性等優(yōu)點。實現(xiàn)重金屬免疫分析測定技術(shù)關(guān)鍵在于合成的重金屬全抗原以獲得相應(yīng)抗體。

重金屬全抗原的制備，傳統(tǒng)一步螯合法是采用雙功能螯合劑先與載體蛋白結(jié)合得到載體蛋白-螯合劑復(fù)合物，再向其中加入重金屬離子一步螯合制得全抗原。在傳統(tǒng)一步螯合反應(yīng)中，由于重金屬離子會嚴重破壞載體蛋白的二級結(jié)構(gòu)，使載體蛋白變性，載體蛋白的變性程度與重金屬離子的濃度成正相關(guān)性；然而，為了得到較高的半抗原偶聯(lián)比，必須提高重金屬離子的起始反應(yīng)濃度，因此，傳統(tǒng)一步螯合法制備重金屬全抗原在保存全抗原中載體蛋白的活性與提高半抗原偶聯(lián)比之間存在矛盾，必然使所制備的重金屬抗原偶聯(lián)率低或活性低。

發(fā)明內(nèi)容

針對重金屬與蛋白快速大量結(jié)合后易導(dǎo)致蛋白變性這一特點，本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有方法合成的全抗原偶聯(lián)率低、活性低、免疫效果差的問題，改良傳統(tǒng)一步螯合法，制備出高偶聯(lián)率、高活性、免疫原性好的重金屬全抗原。

實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下：通過改良重金屬全抗原的合成順序，首先將過量的重金屬離子與雙功能螯合劑反應(yīng)，反應(yīng)完全后，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，離心沉淀，去除過量的重金屬離子，獲得金屬離子-螯合劑復(fù)合物，使之與生物大分子的反應(yīng)能力減弱，然后將金屬離子-螯合劑復(fù)合物與載體蛋白偶聯(lián)，保證了所制備全抗原中蛋白的活性，制備了具有高偶聯(lián)率、高活性的重金屬全抗原。?

本發(fā)明的工藝步驟是：

（1）配置濃度為0.1?×?10^?3mol/L?~10.0×10^-3?mol/L的雙功能螯合劑[(R)-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙基]-（S-S）環(huán)己烷-1,2二乙基三胺五乙酸p-NH2-Bn-CHX-A”-DTPA溶液，向其中振蕩滴加濃度為0.1?mol/L?~1.0?mol/L的重金屬鹽溶液，要求加入的重金屬離子與雙功能螯合劑的物質(zhì)的量之比n_重：?n_螯＝1～10：1，每2-10s滴加一滴，得溶液A；重金屬離子是Hg²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺、Cr²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺中的一種，重金屬鹽溶液是硝酸鹽或鹽酸鹽；

（2）將溶液A在10-35℃避光恒溫反應(yīng)8h～30h，反應(yīng)完全后，用0.1?mol/L?NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0~10.0，3000r/min離心10min去沉淀,得溶液B；?

（3）配置濃度為1.0?×?10^?4mol/L?~5.0×10^-4?mol/L的載體蛋白溶液，向其中振蕩滴加上述溶液B，要求加入的螯合劑與載體蛋白的物質(zhì)的量之比n_螯：n_蛋白＝40～70：1，每2~10s滴加一滴；20分鐘后再向反應(yīng)液中加入偶聯(lián)劑戊二醛，要求加入的偶聯(lián)劑與螯合劑的物質(zhì)的量之比n_偶：n_螯＝1~5：1，每2~10s滴加一滴；反應(yīng)完全后，得溶液C；載體蛋白是牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白HAS、鑰孔血藍蛋白KLH、卵清蛋白OVA、甲狀腺球蛋白BTG中的一種；