[發明專利]一種應用生物反應器制備抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法

有效

• 申請號: 201210322356.8
• 申請日: 2012-09-04
• 公開（公告）號: CN102936612A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 李偉;劉潔;秦紅剛;漆世華;溫文生;朱薇;謝紅玲;韓興;王楨楨;廖園園;李建;王威
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: C12P21/08
• 分類號: C12P21/08
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 唐正玉

技術領域

本發明涉及單克隆抗體技術領域，具體涉及一種應用生物反應器制備抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法。

背景技術

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒引起的一種高度接觸性傳染病，俗稱狗瘟，該病的傳染性極強，死亡率高達80％以上。接種犬瘟熱疫苗是預防犬瘟熱最為有效的途徑之一。近年來，在廣泛應用犬瘟熱疫苗防治犬瘟熱的同時，世界各地仍有犬或野生動物感染犬瘟熱病毒，并造成犬瘟熱流行的報道，且犬瘟熱病毒的變異使得痊愈犬仍可傳染犬瘟熱病毒。

單克隆抗體具有特異性高、靈敏性好和重復性優等特點，常用于診斷和治療犬瘟熱病毒引起的相關疾病。其中，抗犬瘟熱病毒的單克隆抗體為犬瘟熱的診斷和治療提供良好的基礎。此外，抗犬瘟熱單克隆抗體對犬瘟熱的臨床診斷、流行病學調查、病原學研究等方面都有積極和重要的意義。

迄今為止，抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備方法主要采用動物體內培養法，所使用的生產動物多為BALB/c小鼠，具體步驟為：1）將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內，雜交瘤細胞在小鼠腹腔內生長并產生腹水；2）從所產生的腹水中提取分離雜交瘤細胞所生成的單克隆抗體。該方法制得的單克隆抗體濃度高，且具有操作簡便、經濟等優點，但產量有限，無法實現工業規模化生產，同時腹水中常混有小鼠的各種雜蛋白（包括IgG），需要提純后才能使用，并有污染動物病毒的危險。因此，急需研究新的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的制備方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種應用生物反應器制備抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法，本發明的方法克服了傳統動物體內生產工藝產品雜蛋白含量高、產品質量不穩定、批間差大等缺陷，具有培養基成分明確、過程和質量可控、抗體純度高、操作簡便、生產效率高、產品純度高、穩定性好等優點。

本發明的技術方案為：

一種應用生物反應器制備抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的方法，包括如下步驟：

1）將分泌抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株進行無血清懸浮適應培養；

2）在生物反應器內分兩階段培養所述雜交瘤細胞；

3）收獲培養上清液；

4）將收獲的上清液進行超濾、凍干，制得抗犬瘟熱病毒單克隆抗體成品。

本發明的優選技術方案中，所述雜交瘤細胞株選自能夠穩定分泌抗犬瘟熱病毒單克隆抗體的鼠雜交瘤細胞株，優選所述的鼠雜交瘤細胞株為HB-216雜交瘤細胞株。

本發明的優選技術方案中，步驟2）中在生物反應器內分兩階段培養雜交瘤細胞包括雜交瘤細胞的細胞生長階段和抗體分泌階段，其中，細胞生長階段以獲取細胞量為主，抗體分泌階段以持續獲得大量分泌性抗體為主。

本發明的優選技術方案中，所述細胞生長階段的培養條件為：溫度為36℃-37℃、攪拌轉速為120?RPM?-180RPM、溶氧（DO）為30%-80%和pH為7.0-7.2。

本發明的優選技術方案中，所述抗體分泌階段的培養條件為：溫度為34℃-35℃、攪拌轉速為120RPM-180RPM、溶氧（DO）為30%-80%和pH為7.2-7.4。

本發明的優選技術方案中，所述生物反應器選自攪拌式生物反應器、激流式生物反應器中的任一種或其組合。

本發明的優選技術方案中，步驟2）生物反應器內分兩階段培養所用的培養基選自Hybridoma-SFM無血清培養基、PFHM-II無血清培養基中的任一種或其組合。

本發明的優選技術方案中，步驟2）中生物反應器內的培養方法選自分批培養法、補料分批培養法、灌注培養法中的任一種或其組合。

本發明的優選技術方案中，所述分批培養法為在生物反應器內放入一定量的培養基后，接入適量細胞，使其生長繁殖，一次性收獲產品。

本發明的優選技術方案中，所述補料分批培養法為在分批培養過程中補加新鮮的培養基或營養物質，一次性收獲產品，其中，補料所用培養基為原倍培養基或濃縮了2-5倍的培養基，優選為濃縮了3-4倍的培養基，并間歇補加營養物質或流加營養物質，其中，所述的營養物質選自葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物、乳清蛋白水解物的任一種或其組合。

本發明的優選技術方案中，所述灌注培養法為細胞接種生物反應器后所進行的培養，新鮮的培養基不斷加入生物反應器，同時又連續不斷的排出廢液或連續收獲產品，其中，優選的灌注體積為0.5-3個工作體積/天，通過更改蠕動泵轉速來調節灌注速率。