[發明專利]一種雙標記重組家蠶桿狀病毒及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210321448.4
• 申請日: 2012-09-03
• 公開（公告）號: CN103667348A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 張耀洲;王俊祥;陳劍清;舒特俊
• 申請（專利權）人: 天津耀宇生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/85
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾

1.一種雙標記重組家蠶桿狀病毒，其特征在于，該病毒含有桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因、增強型綠色熒光蛋白EGFP基因和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串聯基因SP-EGFP-TM，以及桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因和紅色熒光蛋白RFP基因形成的串聯基因RFP-VP39或VP39-RFP。

2.根據權利要求1所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒，其特征在于，所述串聯基因SP-EGFP-TM的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；所述串聯基因RFP-VP39的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；所述VP39-RFP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。

3.權利要求1或2所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于，步驟如下：

（1）依次串聯桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因、增強型綠色熒光蛋白EGFP基因和桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因，形成串聯基因SP-EGFP-TM；串聯桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因序列和紅色熒光蛋白RFP基因序列，形成串聯基因RFP-VP39或VP39-RFP；?

（2）將串聯基因SP-EGFP-TM和RFP-VP39，或SP-EGFP-TM和VP39-RFP插入到病毒表達載體的多克隆位點，構建成重組桿狀病毒轉座載體；

（3）重組桿狀病毒轉座載體轉化大腸桿菌感受態細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素、X-gal和IPTG的LB培養基上培養40~48小時，挑取白斑，培養20~24小時后抽提基因組進行PCR鑒定，鑒定正確的為雙標記重組家蠶桿狀病毒。

4.根據權利要求3所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟（1）桿狀病毒囊膜蛋白gp64信號肽SP基因的擴增引物為SEQ?ID?NO:4~5，桿狀病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因的擴增引物為SEQ?ID?NO:?6~7，增強型綠色熒光蛋白EGFP基因的擴增引物為SEQ?ID?NO:?8~9，紅色熒光蛋白RFP基因的擴增引物為SEQ?ID?NO:?10~11或SEQ?ID?NO:12~13，桿狀病毒衣殼蛋白VP39基因的擴增引物為SEQ?ID?NO:?14~15或SEQ?ID?NO:16~17。

5.根據權利要求3所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟（2）所述病毒表達載體為pFastBac-Dual。

6.根據權利要求5所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟（2）所述串聯基因SP-EGFP-TM插入到載體pFastBac-Dual的P_p10啟動子后的多克隆位點；串聯基因RFP-VP39或VP39-RFP插入到載體pFastBac-Dual的P_pH啟動子后的多克隆位點。

7.根據權利要求6所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于串聯基因SP-EGFP-TM是通過SmaⅠ和XhoⅠ雙酶切位點插入的；串聯基因RFP-VP39或VP39-RFP是通過BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切位點插入的。

8.根據權利要求3所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟（2）所述大腸桿菌為DH10Bac。

9.根據權利要求3所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒的制備方法，其特征在于步驟（3）所述PCR的擴增引物如SEQ?ID?NO:18~19所示。

10.權利要求1或2所述的雙標記重組家蠶桿狀病毒作為家蠶核型多角體病毒模式生物的應用。