[發(fā)明專利]一種人類糞便DNA提取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210320895.8
• 申請日: 2012-09-03
• 公開（公告）號: CN102864138A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦?zé)?/a>;畢婷婷;阮麗娟;陳標(biāo)榜;余向東
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江世紀(jì)康大醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及自非損傷性取樣材料中提取DNA的方法，具體涉及一種人類糞便DNA提取方法。

背景技術(shù)

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)生率僅次于胃癌和食道癌。近二十年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率在逐漸增加，同時(shí)，其發(fā)病年齡趨向老齡化。在西方發(fā)達(dá)國家，結(jié)直腸癌是僅次于肺癌的第二位惡性腫瘤。近年來的一些研究表明K-ras，P53，APC，MMR等一些基因的突變會(huì)導(dǎo)致正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞（Vogelstein，B.?and?Kinzler，K.W.，1993），對這些基因突變的研究進(jìn)展，使得通過糞便DNA檢測診斷結(jié)直腸癌成為一種可能。正常人的糞便每天大約可排泄接近10¹⁰個(gè)上皮細(xì)胞，對脫落到糞便里的結(jié)腸黏膜細(xì)胞進(jìn)行分子檢測是結(jié)直腸癌的一種理想的篩查手段。近年來關(guān)于試圖從糞便樣品中檢測結(jié)直腸癌的致病基因已成為一個(gè)熱點(diǎn)的研究領(lǐng)域（Parsons，B?et?al.，1995；Sidransky，D?et?al.，1992；Ahlquist，D.A?et?al.，2000；Dong，S.M?et?al.，2001）。然而在用此方法進(jìn)行臨床診斷之前還有許多難題需要解決，比如，在樣本的采集和分離過程中往往會(huì)因?yàn)镈NA酶的降解，各種酶阻抑劑（粘液、細(xì)菌和食物殘?jiān)鹊龋┖湍扄}的存在導(dǎo)致從糞便里提取出來的人體DNA產(chǎn)量非常少或者提取出的DNA難以用于PCR擴(kuò)增。為了穩(wěn)定可靠的進(jìn)行結(jié)直腸癌的分子診斷，近年來也有許多的研究，通過多組提純和擴(kuò)增方法對照來改進(jìn)DNA樣本的質(zhì)量（Monteiro，L?et?al.，2001；Deuter，R?et?al.，2001；Machiels,?B.M?et?al.，2000；Ito,?Y?et?al.，2002）。然而大多數(shù)的研究方法操作都很繁瑣而且耗時(shí)（比如大量苯酚的應(yīng)用），市面上已有的一些糞便DNA提取試劑盒并不能完全解決這些難題，而且價(jià)格昂貴。

近年來，基因診斷在人類多種腫瘤、疾病的早診、治療以及預(yù)后評估中受到廣泛重視。進(jìn)行基因診斷的首要工作是樣品的采集和DNA樣本的提取。過去采樣的方法主要有兩種：一是傷害性取樣，即獲取病人的病理組織和血液等組織樣本，這種方法會(huì)對病人造成疼痛；二是非傷害性取樣，即通過獲取病人的毛發(fā)、指甲等分析樣品，雖然該方法不會(huì)對病人造成疼痛，但是從這些樣品中抽提出的痕量DNA由于含量太少，很難用來進(jìn)行分子診斷。

非損傷性取樣是在不觸及或者不傷害人體本身的情況下，通過收集人的毛發(fā)、糞便、尿液、食物殘?jiān)ê锌谇幻撀涞募?xì)胞）等不同形式的分析樣品而進(jìn)行DNA的提取和分析。在非損傷性取樣材料中，糞便是一種理想的的分析樣品，原因包括:一、人類排便具有節(jié)律性，相對于其他非損傷性取樣材料來說，樣品充足，易于采集；二、糞便樣品可以在不接觸樣品來源人的情況下直接獲取，對人的干擾小；三、采集糞便樣本可以顯著降低采樣花費(fèi)成本。因此該方法排除了傳統(tǒng)對病人取樣方法的種種不利因素，近年來已被成功運(yùn)用于物種鑒別（通過對線粒體DNA的擴(kuò)增）、個(gè)體識(shí)別（微衛(wèi)星擴(kuò)增）、動(dòng)物性別鑒定（對Y染色體上的SRY基因進(jìn)行擴(kuò)增）、種緣關(guān)系的鑒定（對線粒體控D環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增）、母系鑒定（通過對線粒體DNA的擴(kuò)增）、親子鑒定（對微衛(wèi)星進(jìn)行擴(kuò)增）、種群數(shù)量估計(jì)（對微衛(wèi)星進(jìn)行擴(kuò)增）等等（Kohn?and?Wayne，1997）。這些研究推動(dòng)了糞便樣品的采集及其保存方法和提取前的取樣方法的進(jìn)步。

由于糞便里含有很多的細(xì)菌，核酸內(nèi)切酶，樣品DNA很容易降解，所以采集來的糞便樣品需盡快保存，保存方法一般是低溫處理，即冷凍保存。

以糞便為材料提取DNA進(jìn)行研究的關(guān)鍵是能否提取到高純度的DNA。自糞便DNA分析技術(shù)發(fā)展起來之后，國內(nèi)外在這方面取得了巨大的進(jìn)步，發(fā)展了多種糞便DNA提取方法（Constable?et?al.，1995；Savill?et?al.，2001；鐘華等，2003；張保衛(wèi)等，2004）。但實(shí)際應(yīng)用中依然存在難題：由于糞便材料的特殊性，如樣品的采集、保存等等相關(guān)環(huán)節(jié)因素都會(huì)影響到DNA提取的結(jié)果（Frantzen?et?al.，1998；Piggott?and?Taylor，2003）。目前國內(nèi)外文獻(xiàn)資料均未對這些影響因素予以介紹，因此根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的論文中提供的方法進(jìn)行糞便DNA提取，無法從現(xiàn)有文獻(xiàn)資料中獲得足夠的信息來指導(dǎo)糞便DNA提取研究，得不到預(yù)期的效果。

發(fā)明內(nèi)容