[發明專利]一種肺炎鏈球菌核酸定量檢測引物、熒光探針、試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201210320532.4
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102876774A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 唐景峰;羅虹;王業富
• 申請（專利權）人: 武漢百泰基因工程有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/46
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，特別涉及一種肺炎鏈球菌核酸定量檢測引物、熒光探針、試劑盒及其檢測方法。?

背景技術

肺炎鏈球菌（Streptococcus?pneumoniae，SP）屬鏈球菌科鏈球菌屬細菌，革蘭染色陽性。它不產生內、外毒素，其致病性主要是莢膜的侵襲作用：無莢膜的變異株無毒力，有莢膜的肺炎球菌可抵抗吞噬細胞的吞噬，有利于細菌在宿主體內定居并繁殖。根據細菌莢膜的多糖抗原性可將肺炎鏈球菌分為多于90種血清型，不同血清型具有不同的致病性。?

75%的成年人肺炎鏈球菌肺炎及50%以上嚴重的肺炎鏈球菌菌血癥是由1～84型肺炎鏈球菌引起。成人肺炎鏈球菌肺炎中75%由1、2、3、4、5、7、8、12、14和19型引起，其中3型產生大量莢膜物質，毒性強而且病死率高。肺炎鏈球菌6、14、19及23型，常引起兒童肺炎鏈球菌性疾病，其中第14型肺炎鏈球菌感染最常見，可繼發胸膜炎、膿胸、中耳炎、腦膜炎和敗血癥等。肺炎鏈球菌主要引起呼吸道感染，是目前常見的飛沫和呼吸道分泌物傳播疾病。肺炎鏈球菌感染率與年齡、性別、地區和季節有關，在免疫能力弱或有不良生活習慣的人群中更容易被感染，也常在家庭、學校、托兒所或軍隊等密集人群中小規模流行。肺炎鏈球菌也可侵入機體其它部位，引起繼發性胸膜炎、中耳炎、乳突炎以及心內膜炎等。因此對肺炎鏈球菌感染要盡快針對不同病情給以恰當的治療。隨著科技的進步，各種各樣新的檢測方法也都已應用到致病菌的檢測中。現有技術中對肺炎鏈球菌的快速檢測方法如下：1、傳統的培養方法（國標法），即從血液或胸腔積液培養分離獲得SP仍然作為診斷的金標準；2、乳膠凝集法，該法是一種針對肺炎球菌莢膜抗原的免疫學凝集方法；3、自動化方法，目前微生物檢測的自動化儀器已普遍使用，對于肺炎鏈球菌檢測常見方法有：API?20?Strep鑒定試條、VlTEK?AMS系統、PHOENIX?SMIC／ID鑒定板和MICRO-SAN?Walk?Away等；4、免疫層析法(Immunochromatography，ICT)，目前廣泛用于SP診斷的快速方法，其檢測為SP各血清型所共有的抗原C多糖。該方法可用于檢測尿液、胸腔積液、腦脊液和支氣管灌洗液；5、核酸擴增技術，PCR（Polymerase?Chain?Reaction，聚合酶鏈式反應）屬于一種核酸體外擴增?技術，靠寡核苷酸指導的DNA合成的重復循環來實現對靶核酸序列的擴增，并采用凝膠電泳或探針雜交檢測擴增的DNA；6、實時熒光定量PCR技術。?

但上述的方法中仍然存在不足之處：采用傳統的培養方法（國標法）、乳膠凝集法、免疫層析法和核酸擴增技術檢測，會出現假陽性或假陰性結果，影響實驗結果的準確性；自動化方法由于自動化鑒定系統是根據數據庫中所提供的背景資料鑒定細菌，數據庫資料的不完整將直接影響鑒定的準確性，而且目前尚無一個能包括所有細節鑒定資料的鑒定系統；核酸擴增技術雖然結果好于上述4種方法，但是PCR擴增產物需要進行后處理，而PCR產物后處理時存污染，仍會導致假陽性結果，并且會對環境造成污染，對實驗人員有潛在的危害；實時熒光定量PCR技術雖然解決了核酸擴增技術污染的問題，而且比核酸擴增技術的檢測結果特異性更高，但仍不能達到100%的特異性。?

發明內容

為了解決現有技術中的問題，本發明實施例提供了一種對病原體的核酸具有高特異性及高靈敏度的引物和熒光探針，由其制備的能夠快速、準確地對病原體直接進行精確定量檢測的試劑盒及其檢測方法，所述技術方案如下：?

首先，一種肺炎鏈球菌核酸定量檢測的引物和熒光探針，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：?

正向引物如序列表中SEQ?ID?NO.1；?

反向引物如序列表中SEQ?ID?NO.2；?

熒光探針如序列表中SEQ?ID?NO.3；?

或者所述正向引物、反向引物和熒光探針的序列分別為上述序列SEQ?ID?NO.1~SEQ?ID?NO.3的5'端和/或3'端有延長的核苷酸片段的序列，如序列表中SEQ?ID?NO.5~SEQ?ID?NO.7；?

或者所述正向引物、反向引物和熒光探針的序列分別為與上述序列SEQ?ID?NO.1~SEQ?ID?NO.3的同源性大于85%的序列，如序列表中SEQ?ID?NO.8~SEQ?ID?NO.10；?