[發(fā)明專利]一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210320070.6
• 申請日: 2012-08-30
• 公開（公告）號: CN102851340A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳紅云;李建正;范超杰
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州后羿制藥有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州睿信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

1）重組表達(dá)工程菌E.coli?BL21(DE3)/pET22b(+)/ChIFNα種子制備：

將重組表達(dá)工程菌E.coli?BL21(DE3)/pET22b(+)/ChIFNα按1%的比例接種菌液于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；將培養(yǎng)液接種至含Amp的LB平板，劃線培養(yǎng)，挑取單菌LB中搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)OD_600nm＝0.5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保存；

2）工程菌E.coli?BL21(DE3)/pET22b(+)/ChIFNα發(fā)酵種子液制備：

將保存的工程菌E.coli?BL21(DE3)/pET22b(+)/ChIFNα種子按0.05-0.1%體積的量接種于2×YT培養(yǎng)液中培養(yǎng)，作為發(fā)酵罐用種子液；

3）工程菌E.coli?BL21(DE3)/pET22b(+)/ChIFNα發(fā)酵生產(chǎn)：

菌體培養(yǎng)階段：發(fā)酵培養(yǎng)基高溫滅菌后，每升培養(yǎng)基加入100mg的Amp，按5-10%體積的量接入種子液，通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)過程調(diào)節(jié)pH7.2；

碳源飼喂階段：碳源耗完，流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，溶氧量維持在30％，培養(yǎng)過程調(diào)節(jié)pH7.2；

誘導(dǎo)表達(dá)階段：繼續(xù)連續(xù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基；加入IPTG，在IPTG終濃度0.5mM條件下誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)pH7.2，溶氧量維持在30％，誘導(dǎo)4h停罐；

4）重組雞α干擾素的純化：

取上述發(fā)酵液，5000rpm離心10min收集菌體，經(jīng)PBS緩沖液洗滌后PBS緩沖液重懸，超聲30min，10000rpm，4℃，離心10min收集沉淀，PBS緩沖液洗滌沉淀，然后用變性緩沖液溶解沉淀，10000rpm，4℃，離心10min，收集上清液，將上清液緩慢加入復(fù)性緩沖液中，4℃靜置48h，10000rpm，4℃，離心20min，收集上清液，即得到含有高效雞基因工程雞干擾素α的溶液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在于，所述步驟1）中含Amp的LB培養(yǎng)基中Amp的量為100μg/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在于，所述步驟1）中的振蕩培養(yǎng)條件為30℃，200rpm，培養(yǎng)8-10h。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在于，所述步驟1）中的保存條件為-20℃。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在于，所述步驟2）中2×YT培養(yǎng)液的組成為蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖1.0g、NaCl?5.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000ml、pH?7.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在于，所述步驟2）中2×YT培養(yǎng)液中培養(yǎng)條件為30℃，200rpm，培養(yǎng)5-12h。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效雞基因工程雞干擾素α的制備方法，其特征在于，所述步驟3）中通氣攪拌培養(yǎng)條件為37℃，培養(yǎng)8-10h。