[發明專利]柯薩奇病毒A10核酸檢測用引物、探針及試劑盒

無效

• 申請號: 201210319712.0
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102827952A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 何雅青;陳龍
• 申請（專利權）人: 何雅青;陳龍
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市匯力通專利商標代理有限公司 44257
• 代理人: 李保明;閻蕊香

技術領域

本發明涉及生物檢測技術，具體地說涉及柯薩奇病毒A10核酸檢測用引物、探針及試劑盒。

技術背景

柯薩奇病毒A10(coxsackievirusA10，簡稱CVA10)為單股正鏈RNA病毒，屬小RNA病毒科(Picoranviridae)，根據其分子遺傳特征，CVA10屬于人類腸道病毒A類(human?enterovirus?A,簡稱HEV-A)。CVA10作為人類感染性疾病的一種病原，能引起多種疾病，如手足口病、皰疹性咽峽炎及脫甲病等。手足口病的一種主要病原體人類腸道病毒71(human?enterovirus?71,簡稱HEV71)已在亞太地區流行了十多年，在中國大陸自1998年以來一直以C4基因型循環傳播。然而，在近幾年爆發的幾起手足口病中，除了主要病原體HEV71外，還有多種人類腸道病毒參與感染，其中CVA10就是常見的一種。并且，近幾年CVA10開始在歐洲流行，且有在全球流行并引起流行病爆發的可能。如2008芬蘭爆發的手足口病，2010法國爆發的皰疹性咽峽炎和手足口病都以CVA10和CVA6為主，CVA10還引起了2008年西班牙的手足口病的流行，并引發了脫甲病。另外，健康人群人類腸道病毒隱性感染的調查結果顯示HEV-A表現出高度的流行，其中CVA10是其中之一。我國深圳地區近幾年手足口病的病原學調查結果顯示，CVA10的感染比例表現出上升的趨勢。

CVA10的感染一年四季均可發生，其主要通過糞-口途徑在人群中傳播，帶毒的糞便可通過污染的手、餐具、食物經口進入人體，咳嗽、打噴嚏形成的飛沫可直接或間接進行傳播，另外，接觸病人破潰的皰疹液等也受到感染。CVA10作為一種潛在的威脅，為了更好地應對CVA10的感染所引發的疾病流行，提供一種快速、準確的檢測技術顯的尤為重要。

本發明選擇柯薩奇病毒A10的VP1基因設計用于熒光RT-PCR檢測的引物及探針序列，建立了柯薩奇病毒A10熒光RT-PCR檢測技術，反應結束即可根據擴增曲線判定是否感染柯薩奇病毒A10。

發明內容

本發明目的在于提供用于柯薩奇病毒A10實時熒光RT-PCR檢測的引物、探針及試劑盒。

本發明在分析已報道的柯薩奇病毒A10VP1基因序列基礎上，分別設計引物及熒光探針，所述的引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?No:1和SEQ?ID?No:2所示。

本發明設計的探針的核苷酸序列如SEQ?ID?No:3所示，該探針一端標記有報告熒光染料，另一端標記有淬滅熒光染料。其中，報告熒光染料可以采用下列熒光基團中的任意一種：FAM、HEX、TET、JOE、ROX和CY5，淬滅熒光染料可采用下列熒光基團中的任意一種：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2和BHQ3。

根據TaqMan技術，在常規PCR的基礎上添加了一條標記有兩個熒光染料基團的核苷酸探針，例如將報告熒光染料標記在探針的5’端，淬滅熒光染料標記在探針的3’端，兩者構成能量轉移結構，即報告熒光染料所發射的熒光可被淬滅熒光染料吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強。在擴增反應過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅熒光染料的抑制作用消失，報告熒光染料信號增強，從而實現對柯薩奇病毒A10核酸的實時檢測。

本發明提供的試劑盒，包括上述正向引物和反向引物。

優選地，試劑盒還包括上述探針。

優選地，試劑盒還包括實時熒光RT-PCR反應液，與所述正向引物、反向引物和探針共同構成實時熒光RT-PCR檢測體系，25μl所述實時熒光RT-PCR檢測體系的配置為：2×OneStep?RT-PCR?Buffer?12.5μl，10μM所述正向引物1.5μl，10μM所述反向引物1.5μl，10μM所述探針0.5μl，Rox?Reference?Dye?Ⅱ(50×)0.5μl，5U/μl?Ex?Taq?HS?0.5μl，40U/μlPrimeScript?RT?enzyme?Mix?0.5μl，RNA?5μl，RNase?Free?dH₂O?2.5μl。

優選地，試劑盒的檢測反應條件為：50℃反轉錄20min，95℃變性3min，以95℃15s，60℃40s(收集熒光信號FAM)擴增45個循環。

當然，可以根據本發明給出的引物對或者其擴增產物序列設計其他類型的探針，以適用不同方法的熒光PCR檢測。