[發(fā)明專利]小鼠胎肝細(xì)胞PL08及其建立方法和在紅細(xì)胞前體細(xì)胞培養(yǎng)與增殖中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210316587.8
• 申請(qǐng)日: 2012-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN102965334A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李鵬;劉志新
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類號(hào): C12N5/073
• 分類號(hào): C12N5/073;C12N5/078
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及利用一種新細(xì)胞系，特別是小鼠胎肝細(xì)胞PL08[保藏日期：2012年8月3日、保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）、保藏編號(hào)：C201297]及其建立方法和應(yīng)用。?

背景技術(shù)

紅細(xì)胞前體細(xì)胞（erythroid?progenitors）由造血干細(xì)胞分化而來，可以繼續(xù)分化為成熟的紅細(xì)胞。紅細(xì)胞前體細(xì)胞在應(yīng)急性輸血和治療貧血癥等臨床應(yīng)用上有廣泛需求。人類的紅細(xì)胞前體細(xì)胞（或稱為有核紅細(xì)胞），其主要表面標(biāo)記分子為GPA和CD71。?

目前，臍帶血紅細(xì)胞前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)仍然十分困難。找到有效的方法在體外擴(kuò)增和培養(yǎng)臍帶血紅細(xì)胞前體細(xì)胞是當(dāng)前該領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的為：提供一種新的小鼠胎肝細(xì)胞系PL08及其建立方法，以及該細(xì)胞系在體外培養(yǎng)和增殖臍帶血紅細(xì)胞前體細(xì)胞。?

技術(shù)方案為：使用PL08細(xì)胞系作為基質(zhì)細(xì)胞，與臍帶血紅細(xì)胞?前體細(xì)胞共培養(yǎng)。?

PL08細(xì)胞系是發(fā)明人建立的一株小鼠胎肝細(xì)胞系。其建立的過程如下：?

取C57/BL6小鼠第11天的胎肝，用帶有27G針頭的無菌注射器反復(fù)吹打，以使組織解離，分散為單個(gè)細(xì)胞。用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，將細(xì)胞培養(yǎng)在0.1％明膠包被過的細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)基成分為：aMEM培養(yǎng)基，添加15％的胎牛血清。經(jīng)過4到5天的培養(yǎng)，去除上清，將貼壁細(xì)胞用0.05％的胰酶消化下來，常規(guī)方法擴(kuò)大培養(yǎng)、傳代，每次傳代過程中保留30％的原培養(yǎng)液，添加70％的新鮮培養(yǎng)液。在本實(shí)驗(yàn)室，PL08細(xì)胞系已經(jīng)穩(wěn)定傳代60代以上，培養(yǎng)時(shí)間超過1年，細(xì)胞大小均一，生長速度穩(wěn)定。?

PL08細(xì)胞系為亞三倍體核型，染色體條數(shù)為58-62條（見圖1）。該細(xì)胞系在添加10％胎牛血清的aMEM培養(yǎng)基中生長良好，接種后1至2天的細(xì)胞群體倍增時(shí)間為22.4小時(shí)，最適生長溫度為37攝氏度，最適生長PH值為7.2。?

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PL08細(xì)胞系可以很好的支持臍帶血紅細(xì)胞前體細(xì)胞的生長，在體外培養(yǎng)紅細(xì)胞前體細(xì)胞的研究中有巨大的應(yīng)用價(jià)值。?

附圖說明

圖1為該細(xì)胞系124代核型分析圖像。?

圖2是培養(yǎng)細(xì)胞顯微圖像。?

圖3是臍帶血紅細(xì)胞前體細(xì)胞在普通培養(yǎng)條件下和與PL08共培?養(yǎng)條件下，在不同的培養(yǎng)時(shí)間段做流式細(xì)胞分析的結(jié)果。?

圖4是臍帶血紅細(xì)胞前體細(xì)胞在普通培養(yǎng)條件下和與PL08共培養(yǎng)條件下培養(yǎng)12天，細(xì)胞形態(tài)比較結(jié)果。?

小鼠胎肝細(xì)胞PL08保藏日期：2012年8月3日；保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）；保藏編號(hào)：C201297。?

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中，所用試劑材料及其來源包括：?

PL08細(xì)胞系由李鵬博士構(gòu)建。臍帶血由廣州臍帶血干細(xì)胞庫提供。流式抗體GPA/CD71為eBioscience產(chǎn)品。StemSpan無血清培養(yǎng)基為STEMCELL公司產(chǎn)品。細(xì)胞因子human?Insulin-like?growth?factor(hIGF)、Human?Erythropoietin(hEPO)、human?stem?cell?factor(hSCF)、human?interleukin?3(hIL3)為PeproTech公司產(chǎn)品。Lipids和Dexametasone為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)板為Corning?Costar公司產(chǎn)品。Lymphoprep淋巴細(xì)胞分離液為Axis-shield公司產(chǎn)品。?

實(shí)施例1PL08作為基質(zhì)細(xì)胞在紅細(xì)胞前體細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用?

臍帶血解凍后，重懸于20ml?PBS緩沖液中。使用Lymphoprep淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞，隨后對(duì)分離到的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。得到的細(xì)胞分兩組培養(yǎng)：第一組作為對(duì)照組，培養(yǎng)在stemspan培養(yǎng)基中，添?加的細(xì)胞因子及濃度如下：lipids(40ug/ml)，Dexametasone(1um)，hEPO(20ng/ml)，hSCF(100ng/ml)，hlGF1(40ng/ml)，hlL3(10ng/ml)。第二組作為實(shí)驗(yàn)組，與PL08基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)基及細(xì)胞因子成分與第一組相同。?

如圖3流式細(xì)胞數(shù)據(jù)所示，實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)12天，18天時(shí)仍有大量的紅細(xì)胞前體細(xì)胞，而對(duì)照組的在第12天就已經(jīng)全部分化，具體表現(xiàn)為不能通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)到GPA⁺/CD71⁺細(xì)胞。如圖4，對(duì)照組細(xì)胞（圖4A）大量死亡，試驗(yàn)組細(xì)胞(圖4B)生長良好，顯示PL08細(xì)胞系對(duì)紅細(xì)胞前體細(xì)胞生長的良好支持作用。?