[發明專利]基于RNA與DNA含量比的微囊藻生長速率實測方法

無效

• 申請號: 201210316508.3
• 申請日: 2012-08-31
• 公開（公告）號: CN102808035A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 朱偉;李明;肖曼;羅永剛;代曉炫;郭麗麗
• 申請（專利權）人: 河海大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

技術領域

本發明涉及藻類生長速率的測定方法，具體涉及一種基于RNA與DNA含量比的微囊藻生長速率實測方法。

背景技術

微囊藻水華造成一系列的生態及環境問題。微囊藻水華是微囊藻細胞生長和聚集綜合的作用，微囊藻原位生長速率測定對微囊藻水華爆發機理的研究以及水華的預報和防治有著重要的作用。由于微囊藻水平及垂向遷移，造成微囊藻原位生長速率無法通過藻細胞密度直接計算獲得。國際上一些研究者建立了一系列的方法和模型，諸如原位圍隔水柱法、FDC法、同位素法等。但圍隔水柱本身改變了原位的水流、化學及光照等條件，再加上浮游動物捕食、深水湖泊中圍隔建立比較困難等原因，造成此方法很難得以實施用來測定真實的生長速率。FDC法需要連續24小時采樣觀測，工作量巨大，而且采集的樣品本身也受微囊藻遷移的影響。同位素法測定復雜而且昂貴，因而無法普遍使用。建立一種快速，能夠通過簡單測試就能夠獲得微囊藻原位生長速率的方法在微囊藻水華爆發機理的研究以及水華的預報和防治中都極為重要的。

微囊藻細胞分裂與DNA的復制是高度統一的，但是僅有當微囊藻細胞中蛋白質等構成細胞的基本有機物質達到一定量時才能夠進行DNA的復制從而實現細胞分裂。控制蛋白質的合成的主要物質是RNA，RNA越多，蛋白質合成越快，細胞分裂越快，反之亦然。在微囊藻生長的過程中，RNA的含量能夠反映微囊藻細胞中蛋白質合成的快慢，從而表征微囊藻的生長速率，微囊藻生長率和RNA含量存在一定的相關關系。由于實際湖泊中的微囊藻經常出現細胞大小的差異，為了消除細胞大小的差異造成利用RNA絕對含量測定微囊藻生長率時出現的誤差，導入單位生物量中RNA含量——RNA相對含量，這一概念應該能夠更為準確地測定生長率。DNA是藻細胞遺傳物質的基礎，細胞中DNA的含量和細胞的大小直接相關并且環境因子對其含量的影響很小，因此可以用RNA與DNA含量比表征RNA的相對含量，通過其與微囊藻生長速率的關系計算微囊藻的原位生長速率。

發明內容

本發明的目的是建立一種簡易、快速的準確測定微囊藻原位生長速率的方法，在實際湖泊中進行一次采樣，在室內通過簡單的檢測藻細胞中RNA和DNA含量，利用RNA與DNA含量比的值可以獲得較為準確的實際湖泊中微囊藻的原位生長速率。

為了實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種基于RNA與DNA含量比的微囊藻生長速率實測方法，其特征在于包括如下步驟：

1)、采集微囊藻樣品；

2)、提取并測定微囊藻細胞中的RNA與DNA的含量；

3)、計算步驟2)中RNA與DNA含量的比值，x為RNA與DNA的含量比，代入標準曲線y=a*ln(x)-b中，得到微囊藻原位生長速率y，其中a=0.720，b=1.540。

步驟3)中標準曲線是采用如下方法繪制的：測定t、t+1時刻微囊藻細胞密度C_t、C_t+1，根據公式μ_t+1=ln(C_t+1/C_t)得到藻密度生長率μ_t+1；

同時提取并測定微囊藻細胞中的RNA與DNA的含量C_RNA、C_DNA，計算每組C_RNA/C_DNA的值；

以μ_t+1作為縱坐標，C_RNA/C_DNA為橫坐標，擬合得到標準曲線y=a*ln(x)-b，其中a=0.720，b=1.540。

步驟1)中采集的微囊藻樣品首先通過顯微鏡，將非微囊藻顆粒物或其他藻類挑出，獲得較純的微囊藻藻液，然后用玻璃纖維膜過濾獲得藻樣。

步驟2)中微囊藻細胞中的RNA與DNA采取相同的提取方法，提取過程為：取藻樣到離心管內，用高速冷凍離心機，離心，棄掉上清液，往離心管中加入高氯酸，80~100℃恒溫水浴下保存20~40min，冷卻至常溫后在離心機14000~18000?r/min的轉速下運行10~20min，第一次取得上清液保存；在離心管內藻團中繼續加入高氯酸，同上處理，再次取得上清液，與第一次的上清液相混合，在混合液中加入濃度為8~12%的三氯乙酸，留作步驟3)測定RNA和DNA的含量。微囊藻細胞中的RNA含量測定采用地衣酚-鹽酸顯色法，DNA含量的測定采用二苯胺法。

本發明提供的一種基于RNA與DNA含量比的微囊藻生長速率實測方法與現有技術相比，具有如下優勢：