[發(fā)明專利]微生物混菌發(fā)酵制備11α-OH-ADD的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210316179.2
• 申請(qǐng)日: 2012-08-31
• 公開（公告）號(hào): CN102827913A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉喜榮;孟浩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南諾凱生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號(hào): C12P39/00
• 分類號(hào): C12P39/00;C12P33/08;C12R1/66;C12R1/06
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及甾體類藥物的生產(chǎn)方法，具體來(lái)說(shuō)是利用微生物混菌發(fā)酵4-AD制備11α-OH-ADD的方法。

背景技術(shù)

甾體類藥物具有抗炎、避孕、利尿、抗毒、抗過(guò)敏、抗休克作用，廣泛用于濕疹、哮喘、風(fēng)濕疾病。近年來(lái)，甾體藥物在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，廣泛應(yīng)用于治療風(fēng)濕、心血管病、膠原性病癥、淋巴白血病、人體器官移植、抗腫瘤、細(xì)菌性腦炎、皮膚病、內(nèi)分泌失調(diào)、老年性疾病等，甾體類藥物還對(duì)某些癌癥，尤其是激素依賴性腫瘤具有一定的療效。甾體類藥物作用范圍廣、產(chǎn)量高，是醫(yī)藥行業(yè)中僅次于抗生素的第二大類藥物。

甾體激素藥物生產(chǎn)中，甾體母核的多個(gè)基團(tuán)需要進(jìn)行修飾，C₁₁α-羥基化反應(yīng)是重要的甾體轉(zhuǎn)化反應(yīng)之一。甾體的C₁₁α-羥基化對(duì)于甾體藥物的合成及結(jié)構(gòu)改造具有重要意義，通過(guò)C₁₁α-羥基化反應(yīng)可以引入高生理活性基團(tuán)，從而大大增加療效，減少副作用，并能改變作用的專屬性。甾體的C₁₁α-羥基化反應(yīng)可以由具有甾體C₁₁α-羥基化能力的微生物完成。

目前，用于甾體C₁₁α-羥基化反應(yīng)的微生物主要有黑根霉(主要為葡枝根霉)?Rhizopus?nigricans、綠僵菌Metanrrhtzium、赭曲霉Aspergillus?ochraceus、黃曲霉Aspergillus?flavus、青霉、諾卡氏菌等。文獻(xiàn)報(bào)道了一些具有較高C₁₁α-羥基化反應(yīng)活性的微生物，曲霉、綠僵菌是近年國(guó)內(nèi)研究較多的甾體C₁₁α-羥基化微生物。但是赭曲霉在轉(zhuǎn)化后期產(chǎn)生與產(chǎn)物難以分離的磚紅色色素，綠僵菌也存在活性不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化不專一的缺點(diǎn)，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。工業(yè)生產(chǎn)上，國(guó)內(nèi)普遍使用黑根霉進(jìn)行C₁₁α-羥基化反應(yīng)，但是現(xiàn)有工藝轉(zhuǎn)化率不高。

當(dāng)抗炎甾體激素藥物的母核C_1,2位置導(dǎo)入雙鍵后，都能成倍的增加抗炎作用，如：醋酸可的松C_1,2位上導(dǎo)入雙鍵后成醋酸脫氫可的松，抗炎作用提高3～4倍，但C_1,2位脫氫甾體激素化合物在動(dòng)物體內(nèi)不能被轉(zhuǎn)化得到，采用化學(xué)方法進(jìn)行脫氫一般是用二氧化硒法，常使產(chǎn)品中帶有少量難以除盡對(duì)人體有害的硒，所以微生物脫氫成為甾體抗炎激素藥物合成中不可缺少的一步。

應(yīng)用于甾體母核A環(huán)脫氫的主要微生物有：簡(jiǎn)單節(jié)桿菌（Arthrobacter?sp.）、棒狀桿菌（Corymebacterium?sp.）、分支桿菌（Mycobacterum?sp.）、芽孢桿菌（Bacillus）、諾卡氏菌（Nocardia?sp.）、恥垢桿菌（Mycobacterium?smemagctis）。一般來(lái)說(shuō)細(xì)菌的脫氫能力比真菌大，研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)甾體母核有脫氫活力的微生物，較多伴生邊鏈降解和C₂₆位羰基還原以及C₉羥基引起B(yǎng)環(huán)打開等作用。

從4-AD制備11α-OH-ADD，現(xiàn)有技術(shù)是分兩步進(jìn)行的，即C_1,2位脫氫和C₁₁位羥基化反應(yīng)，前一步反應(yīng)完成后需要進(jìn)行后處理，加大了產(chǎn)品后處理成本及發(fā)酵能耗，而且降低了產(chǎn)品收率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種發(fā)酵能耗較小，節(jié)約成本并提高產(chǎn)品收率的微生物混菌發(fā)酵制備11α-OH-ADD的方法。

本發(fā)明的11α-OH-ADD的化學(xué)名稱為：11α-羥基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮，4-AD的化學(xué)名稱為雄烯二酮，本發(fā)明的反應(yīng)路線如下：

。

本發(fā)明的赭曲霉Aspergillus?ochraceus?ATCC?18500和節(jié)桿菌Arthrobacter?simplex?ATCC?6946通過(guò)常規(guī)的斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)，得到發(fā)酵用菌。

赭曲霉Aspergillus?ochraceus?ATCC?18500

斜面培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基：土豆培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件：30℃，培養(yǎng)6～7天。

液體種子培養(yǎng)

?????液體種子培養(yǎng)基：