[發明專利]一種檢測柯薩奇病毒A16型RNA的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201210316016.4
• 申請日: 2012-08-30
• 公開（公告）號: CN102816867A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 戴立忠;鄧中平;黃河
• 申請（專利權）人: 湖南圣湘生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/10;C12R1/93
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;歐穎

1.一種檢測柯薩奇病毒A16型RNA的方法，其中使用磁珠法提取和純化柯薩奇病毒A16型（CA16）RNA。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，結合使用磁珠法和實時熒光PCR技術提取純化和檢測CA16RNA。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

步驟A，裂解病毒：每支離心管加入含磁珠的RNA提取溶液和待測樣本，混勻后離心；CA16陰性對照和CA16陽性對照參照與待測樣本相同的方法作RNA提取和純化處理；

步驟B，磁珠吸附核酸：每管加入含4-羥乙基哌嗪乙磺酸和氯化鈉的RNA提取溶液Ⅱ，混勻后靜置；

步驟C，去除雜質：經離心后將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，再緩慢將溶液吸出；

步驟D，洗滌：每管加入含曲拉通和氯化鈉的RNA提取溶液Ⅲ和含礦物油的RNA提取溶液Ⅳ，混勻后離心，將離心管再置于磁珠分離器上進行磁珠分離，靜置分層后將液體吸出丟棄；

步驟E，RNA洗脫：加入含Tris-HCl和EDTA的RNA洗脫液將離心管壁上的磁珠洗脫到管底，混勻并靜置后將離心管再次置于磁珠分離器上，然后將從磁珠上洗脫下來的RNA吸至新的滅菌離心管中；

步驟F，熒光PCR分析：將洗脫磁珠后的待測樣本RNA、CA16陰性對照、CA16陽性對照中均加入含PCR反應緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、引物、探針的PCR反應液和含mMLV酶和H-Taq?DNA聚合酶的CA16酶混合液，在熒光定量PCR擴增儀上進行PCR反應，并分析結果。

4.一種檢測CA16RNA的試劑盒，包括含磁珠的RNA提取溶液、和含用于靶多核苷酸擴增的上游引物CA16-F、下游引物CA16-R和用于靶多核苷酸檢測的探針CA16-P的PCR反應液；其中，上游引物CA16-F的堿基序列為5′-GCCCTAGAGAAAAGGATGAACAACT-3′；下游引物CA16-R的堿基序列為5′-CAAGTGACTTGCCTGTTCCTGG-3；探針CA16-P的堿基序列為5’FAM-CATGCAGTTCAAGAGCAAACACCGTATTGA-BHQ13’。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內標，即為一段長為88堿基對的人工合成DNA序列插入pUC18T載體的重組體，即質粒，其堿基序列為：5’-GCCAATACGACAAATCACCTTGGTCCTCTGTCATCCAGACTTCGCACGTCACGTATTCGAGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。

6.根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，試劑盒中包括如下組分，

①RNA提取溶液Ⅰ：包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和100～400μg/ml的磁珠；

②RNA提取溶液Ⅱ：含4-羥乙基哌嗪乙磺酸和氯化鈉；

③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通和氯化鈉；

④RNA提取溶液Ⅳ：含礦物油；

⑤RNA洗脫液：含Tris-HCl和EDTA；

⑥內標：如上所述的可選擇使用的內標；

⑦PCR反應液：包括5×PCR反應緩沖液，脫氧核糖核苷三磷酸，用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物CA16-F與CA16-R，用于靶多核苷酸檢測的探針CA16-P，用于內標擴增和檢測的上、下游引物IC-F與IC-R和探針IC-P；

⑧CA16酶混合液：含mMLV酶和H-Taq?DNA聚合酶；

⑨CA16陽性對照：標定已知濃度的慢病毒，其濃度為1.00～5.00E+05copie/ml；

⑩CA16陰性對照：滅菌生理鹽水。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，在試劑盒中，

①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸鈉0.2～1.0%（質量/體積）、曲拉通1.0～4.0%（體積/體積），異硫氰酸胍0.2～1.0mol/L和100～400μg/ml的磁珠組成。

8.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，在試劑盒中，

②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸100～300mmol/L、氯化鈉100～300mmol/L，溶液Ⅱ的pH值為6.5±0.2；

③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通0.1～1.0%（體積/體積）和氯化鈉100～300mmol/L。

9.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，在試劑盒中，

⑤RNA洗脫液：含Tris-HCl?0.8～1.2mol/L和EDTA0.1～1.0mol/L；

⑦PCR反應液：包括5×PCR反應緩沖液10μl，0.2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸擴增的上、下游引物CA16-F與CA16-R，0.2～0.4μmol/L的用于靶多核苷酸檢測的探針CA16-P，0.1～0.2μmol/L的用于內標擴增的上、下游引物IC-F與IC-R，0.05～0.2μmol/L的用于內標檢測的探針IC-P；

⑧C?A16酶混合液：包括mMLV酶10～150U/μl和1～10U/μl的H-Taq?DNA聚合酶。