[發明專利]一種豬圓環病毒2型Cap蛋白基因及其應用

無效

• 申請號: 201210315776.3
• 申請日: 2012-08-30
• 公開（公告）號: CN102827259A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 王宏華;于春梅;凌紅麗;蔣皓靜;張園園
• 申請（專利權）人: 青島康地恩藥業股份有限公司;青島寶依特生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C12N15/34;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于家畜基因工程疫苗技術領域，具體涉及一種豬圓環病毒2型Cap蛋白基因及其應用。

背景技術：

豬圓環病毒2型（Porcine?Circovirus?type?2，PCV2）是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning?multsystemic?wasting?syndrome，?PMWS）的病原，該病毒可引起斷奶仔豬發生進行性消瘦、咳嗽、呼吸困難、腹瀉、皮膚蒼白或者黃染、淋巴結腫大、腎臟灰白水腫等癥狀。同時該病毒還會造成一定程度上的的免疫抑制，容易造成其它疾病的繼發或并發感染。自1991年加拿大首次發現臨床豬圓環病毒以來，該病已給全世界養豬業造成了巨大的經濟損失。因此，對豬圓環病毒2型的研究一直是家禽養殖領域的重點之一。

豬圓環病毒2型的Cap蛋白是PCV2的主要結構蛋白，可自我裝配成病毒性粒子，并含有可中和病毒的抗原表位，可誘導機體產生較強的抗體反應并獲得免疫保護，是設計PCV2新型疫苗的首選目標基因。目前，國外已有昆蟲桿狀病毒表達豬圓環病毒2型的Cap蛋白制備的基因工程亞單位疫苗實現商業化應用。但隨著豬圓環病毒2型毒株不斷變異，現有疫苗的免疫保護力不斷下降。因此，篩選當前流行毒株的Cap蛋白進行疫苗研發無疑具有重要的現實意義和市場開發價值。?

發明內容：

本發明的目的是提供一種豬圓環病毒2型Cap蛋白基因及其應用，即一種新的豬圓環病毒2型Cap蛋白基因，及其作為疫苗的應用。

本發明一個方面提供一種圓環病毒2型Cap蛋白，包括氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的蛋白。?

本發明另一個方面涉及編碼上述蛋白的核苷酸，其序列為SEQ?ID?NO：2。

本發明再一個方面涉及圓環病毒2型Cap蛋白在制備豬圓環病毒2型基因工程亞單位疫苗中的應用。

本發明獲得的豬圓環病毒2型基因工程亞單位疫苗經肌肉接種21日齡PCV2陰性斷奶仔豬，接種28日后取血測PCV2抗體，免疫組PCV2抗體全部為陽性，有效率達到100%，而對照組未檢測到抗體。結果顯示制備的重組蛋白免疫原性良好，其進一步制備的豬圓環病毒2型基因工程亞單位疫苗可以引起仔豬的免疫應答。

說明書附圖

圖1：本發明所用的載體構建圖譜。

具體實施方式：

下面結合具體實施方式來進一步描述本發明，但本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的技術方案的情況下可以對本發明的技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明保護范圍內。

一、豬圓環病毒2型Cap蛋白基因的擴增

將臨床分離疑似PMWS的病料處理后接種無PCV1污染的PK-15細胞、盲傳三代后，PCR擴增豬圓環病毒2型基因全長，引物序列如下：

P1:?????5′--GCTGGCTGAACTTTTGAAAG--3′

P2：???5?′--AAATTTCTGACAAACGTTAC--3′

擴增的條件如下：94℃?5min變性，94℃?30S，65℃?30S，72℃?1.5min，30個循環，72℃延伸10min。

擴增產物進行測序后將Cap蛋白基因序列部分在NCBI上Blast比對，同源性最高為97%，表明擴增的樣品為發生變異的病毒株。其翻譯的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。對Cap蛋白基因進行大腸桿菌稀有密碼子改造，改造后的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2。將改造后的Cap蛋白基因的核苷酸（SEQ?ID?NO：2）5′端和3′端分別加上BamH?I和Hind?III酶切位點，送基因公司進行全基因合成。

二、基因工程蛋白表達載體的構建與工程菌的獲得

1、上述擴增得到的Cap蛋白基因雙酶切后連入pET30a載體相應的酶切位點，構建pET30a/mCap表達載體（圖1）。