[發(fā)明專利]一種泰樂菌素的半抗原、人工抗原、單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用

無效

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• 申請日: 2012-08-25
• 公開（公告）號: CN102827222A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉聚祥;王建平;王麗莉;劉靜;張會彩
• 申請（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07H17/08
• 分類號: C07H17/08;C07H1/00;C07K14/765;C07K14/77;C07K1/113;C07K16/44;G01N33/577
• 代理公司: 保定市燕趙恒通知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 13121
• 代理人: 周獻(xiàn)濟(jì)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及食品安全領(lǐng)域，具體涉及一種泰樂菌素的半抗原、人工抗原和單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

大環(huán)內(nèi)酯類藥物是一類具有14～16元環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的抗生素。自1952年發(fā)現(xiàn)代表品種紅霉素以來，已有多個品種問世。獸醫(yī)臨床應(yīng)用的主要有紅霉素、泰樂菌素、替米考星、泰萬菌素、吉他霉素、螺旋霉素、竹桃霉素等，其中泰樂菌素、替米考星和泰萬菌素為動物專用藥物。泰樂菌素對支原體和多種G⁺菌具有很強(qiáng)的抗菌作用。替米考星具有同泰樂菌素相似的廣譜抗菌活性，對革蘭氏陽性菌和某些革蘭氏陰性菌、支原體、螺旋體等有抑制作用。泰萬菌素具有比泰樂菌素更強(qiáng)的抗菌作用。因此，這些藥物在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用非常廣泛。

隨著這些藥物的廣泛應(yīng)用，其在動物性食品中的殘留問題也日益突出。例如，為了控制泰樂菌素的殘留，歐盟于1999年首先禁止泰樂菌素作為飼料添加劑使用。隨后各國相繼制定了一系列關(guān)于泰樂菌素在各種禽畜產(chǎn)品和蜂蜜中的最高殘留限量。中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定泰樂菌素在牛、豬、雞的肉中最大殘留限量為200μg/kg，牛奶中最大殘留限量為50μg/kg。泰樂菌素用于防治蜜蜂幼蟲腐臭病時很容易在蜂蜜中殘留，且在蜂蜜中殘留的泰樂菌素代謝物脫紅霉糖泰樂菌素的半衰期為75天。另外，中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定替米考星在牛、豬、雞的肉中最大殘留限量為200μg/kg，牛奶中最大殘留限量為50μg/kg。因此，非常有必要對動物性食品中這幾種動物專用大環(huán)內(nèi)酯類藥物的殘留進(jìn)行鑒控。

目前，針對泰樂菌素、替米考星和泰萬菌素的殘留檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、免疫分析測定法等。其中免疫分析法逐漸脫離昂貴的儀器和繁瑣的操作，有很高的精確度、靈敏性和特異性，且對技術(shù)要求不高，檢測時間短，適用于大批量樣品快速檢測。因此，免疫分析檢測技術(shù)已逐漸成為世界各國對有毒有害殘留物快速篩選監(jiān)測的主要方法之一，這為大環(huán)內(nèi)酯類藥物的快速檢測提供了一種新的途徑。免疫分析法的核心試劑是抗體。目前，國內(nèi)外針對這幾種動物專用大環(huán)內(nèi)酯類藥物的免疫檢測技術(shù)，均是利用泰樂菌素或替米考星分子中的羥基直接與載體蛋白連接作為免疫原去制備抗體，所得抗體不能識別其他同類藥物。泰樂菌素分子中含有泰樂菌素、替米考星、泰萬菌素及泰樂菌素代謝物脫紅霉糖泰樂菌素的共有結(jié)構(gòu)部分。將此共有結(jié)構(gòu)部分與大分子載體蛋白偶聯(lián)，突出于載體蛋白的表面，也就是將這一共有結(jié)構(gòu)部分作為載體的一個抗原表位暴露給動物免疫系統(tǒng)，能獲得同時識別這幾種藥物及代謝物的廣譜性抗體，為建立和研發(fā)多殘留免疫檢測方法或檢測產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一種泰樂菌素的半抗原。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

一種泰樂菌素的半抗原，其分子結(jié)構(gòu)式如式1所示：

式1。

本發(fā)明的目的之二是提供泰樂菌素半抗原的制備方法。

所述的泰樂菌素半抗原的制備方法，包括如下步驟，

(a)將等物質(zhì)的量的泰樂菌素和6-氨基己酸在水和乙酸的混和液中加熱回流反應(yīng)，得到含半抗原的黃色液體；

(b)將所得黃色液體濃縮蒸發(fā)后得固體，重結(jié)晶，得到固體的泰樂菌素半抗原。

本發(fā)明的目的之三是提供一種泰樂菌素的人工抗原。

一種泰樂菌素的人工抗原，由泰樂菌素半抗原與載體蛋白結(jié)合而成，其分子結(jié)構(gòu)式如式2所示：

式2。

所述的載體蛋白為卵清蛋白或牛血清白蛋白。

本發(fā)明的目的之四是提供一種泰樂菌素人工抗原的制備方法。

所述泰樂菌素人工抗原的制備方法，包括如下步驟：

(a)將式1結(jié)構(gòu)的化合物、氯甲酸異丁酯和三正丁胺溶于N，N-二甲基甲酰胺中，在1～15℃下攪拌反應(yīng)得溶液A；將載體蛋白溶解于磷酸緩沖液中，得溶液B；

(b)將溶液A加入到溶液B中，在1～15℃下攪拌反應(yīng)過夜，得泰樂菌素的人工抗原。

本發(fā)明的目的之五是提供一種泰樂菌素的單克隆抗體。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

一種泰樂菌素的單克隆抗體，是能與泰樂菌素的人工抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白。

本發(fā)明的最后一個目的是提供上述泰樂菌素單克隆抗體的應(yīng)用。

所述泰樂菌素的單克隆抗體的應(yīng)用，是用于泰樂菌素、替米考星、泰萬菌素及脫紅霉糖泰樂菌素的免疫檢測。