[發明專利]同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體

有效

• 申請號: 201210315182.2
• 申請日: 2012-10-14
• 公開（公告）號: CN102839188A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 王玉;于愛蓮;姜世金;施魯笛
• 申請（專利權）人: 泰山醫學院
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/64;C12N5/10;C12N1/21;C12Q1/68
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技術領域

本發明涉及同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體，是用于鑒定外源目的DNA片段是否具有啟動轉錄或起始翻譯功能的載體質粒。?

背景技術

含有篩選標記的轉基因載體在基因工程中具有廣泛的用途。常見轉基因載體包含有一個或多個篩選標記或報告基因，以方便對插入外源核苷酸片段重組質粒的篩選和鑒定。其中熒光蛋白基因在活細胞中的表達產物具有生物活性穩定、信號特異性強、有效活性維持時間長、方便檢測和對外源目的基因表達活性干擾小等特點，所以常利用熒光蛋白基因的表達來研究外源核苷酸片段的功能。通常情況下，同一報告基因載體中僅含有一個熒光蛋白基因，將目的DNA片段克隆到熒光蛋白基因的N端或C端，構建的重組質粒轉染相應宿主細胞，通過檢測熒光蛋白的表達即可判定目的核酸片段是否具有相應功能，但難以同步反映重組報告基因質粒的轉染效率和判定目的DNA的生物功能。?

發明內容

本發明的目的是提供一種同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP，2012年07月06日送藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號，分類命名大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)，保藏號CGMCC?6320。?

本發明構建同向串聯共表達雙色熒光蛋白的報告基因載體所采用的技術方案是：利用基因克隆技術，在親本載體pIRES2-EGFP啟動子pCMV后的Bgl?II位點與SV40polyA序列之間置換入如下DNA序列：自5`至3`方向依次插入紅色熒光蛋白基因DsRed2、優化組合的多克隆酶切位點MCS(包括Sal?I、Spe?I、Sca?I、Pvu?I、Nhe?I、Mlu?I、EcoR?I、Xba?I、BamH?I、Sac?II、Sac?I、Sma?I和EcoR?V，其中Nhe?I為非單克隆位點)、綠色熒光蛋白基因EGFP和Xho?I位點序列(如SEQNO.1中的第609-2085nt)，獲得如SEQNO.1(第1-5408nt)所示核苷酸序列的同向串聯共表達雙色熒光蛋白的新型報告基因載體質粒pDsRed2-MCS-EGFP。?

所述同向串聯共表達雙色熒光蛋白的報告基因載體的DNA分子也屬于本發明的保護范圍。?

含有所述載體分子、所述重組報告基因載體的轉基因重組菌或細胞也屬于本發明的保護范圍。?

本發明的同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體具備經直接酶切、連接構建插入目的DNA的重組報告基因質粒及轉染細胞等簡單操作，就可以用于分析和鑒定插入目的DNA序列生物活性的功用；由pCMV啟動轉錄的多順反子mRNA中，上游紅色熒光蛋白的表達指示轉染效率，下游綠色熒光蛋白的表達與否及其產量反映目的DNA序列是否具有相應生物活性及其活性高低。?

附圖說明

圖1同向串聯共表達雙熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP的構建圖譜。?

圖2載體骨架pΔSG的PCR擴增與克隆鑒定電泳圖譜。?

圖3構建同向串聯共表達雙熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP的電泳圖譜。?

圖4重組報告基因質粒pDsRed2-LTR-EGFP的酶切鑒定電泳圖譜。?

圖5各質粒轉染CHO細胞的熒光檢測結果。?

具體實施方式

下述實施例中如無特殊說明，所用方法均為常規基因克隆方法，所用試劑均可經商業途徑購得。?

實施例?

1.構建同向串聯共表達雙色熒光蛋白報告基因載體pDsRed2-MCS-EGFP?

(1)載體骨架pΔSG的PCR擴增與克隆?

在載體pIRES2-EGFP(PT3267-5，Clontech)的基礎上，設計含有linker序列的引物pΔSG?F、pΔSG?R擴增缺失IRES和EGFP基因片段的載體骨架pΔSG(包括pCMV、PUC?ori、Kan/Neo、SV40polyA功能或基因序列)。?

pΔSG?F：5′-CGCCTCGAGTCTAGATCATAATCAGCCATACC-3′，(含有XhoI、XbaI的識別位點)；?

pΔSG?R：5′-CCGGATATCGAATTCGAAGCTTGAGC-3′，(含有EcoR?I、EcoR?V的識別位點)。?