[發(fā)明專利]食物不耐受血清特異性IgG檢測(cè)試劑盒及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210313953.4
• 申請(qǐng)日: 2012-08-29
• 公開（公告）號(hào): CN102809657A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李會(huì)強(qiáng);王高升;相平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沃克（天津）生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 天津?yàn)I海科緯知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 韓敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種食物不耐受血清特異性IgG檢測(cè)試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)

變態(tài)反應(yīng)性疾病是現(xiàn)代社會(huì)中常見的一種疾病，它是由廣泛存在的變應(yīng)原引發(fā)的，我國(guó)大約有5-10％的人受變應(yīng)原的侵?jǐn)_。引發(fā)過敏反應(yīng)的物質(zhì)稱為變應(yīng)原，其中食物是一種重要變應(yīng)原。人體對(duì)食物敏感可引起食物變態(tài)反應(yīng)，目前認(rèn)為主要有兩種類型：由IgE介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)，反應(yīng)通常發(fā)生迅速，病癥明顯；由IgG介導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，此種反應(yīng)通常在接觸食物幾小時(shí)或幾天后才會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)癥狀，如長(zhǎng)期疲勞、關(guān)節(jié)炎、蕁麻疹、濕疹、頭痛、腸胃功能失調(diào)及其它慢性癥狀。通常情況下，將由食物引起，IgG介導(dǎo)的異常反應(yīng)稱之為食物不耐受。食物不耐受患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生食物特異性IgG抗體，檢測(cè)血清特異性IgG抗體對(duì)于確定不耐受食物鑒別和診斷具有重要價(jià)值。目前臨床上常采用檢測(cè)特異性抗體來確定引起患者不耐受的食物類型，而酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)是常用的檢測(cè)方法。

傳統(tǒng)的食物變應(yīng)原IgG抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)法通常采用的都是直接包被模式，即由生產(chǎn)廠家預(yù)先將變應(yīng)原固相化于作為載體的聚苯乙烯微孔板上，供檢測(cè)人員直接使用。其原理是將變應(yīng)原成份包被于固相載體表面，用其結(jié)合患者血清中的特異性抗體，再通過進(jìn)一步結(jié)合酶標(biāo)記抗體進(jìn)行顯色反應(yīng)來判斷結(jié)果，從而確定患者血清中是否存在包被抗原所對(duì)應(yīng)的特異性抗體。然而，引起食物過敏的物質(zhì)種類繁多，同一患者可對(duì)多種食物過敏，并且存在明顯的個(gè)體差異。在檢測(cè)時(shí)往往需要同時(shí)進(jìn)行多種變應(yīng)原的檢測(cè)，而每一個(gè)患者所需的檢測(cè)組合又各不相同。

傳統(tǒng)試劑常常由生產(chǎn)廠家將多種變應(yīng)原同時(shí)包被于微孔板制成類似套餐性質(zhì)的檢測(cè)組合，由于采用直接包被法，組合方式無法改變。而實(shí)際工作中，每一患者的檢測(cè)需要各不相同，食物過敏組合是個(gè)性化的，這往往與廠家提供的項(xiàng)目組合產(chǎn)生沖突，造成多余的檢測(cè)和漏檢，同時(shí)會(huì)增加檢測(cè)成本。例如：目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室主要使用由BIOMERICA公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫法試劑盒，該試劑盒可同時(shí)檢測(cè)6例患者，每例患者可檢測(cè)(必須檢測(cè))14種食物變應(yīng)原，組合方式不能改變。此外，該試劑盒在固定位置可測(cè)定2條標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)血清特異性IgG進(jìn)行定量。因此，此試劑盒只能進(jìn)行兩次測(cè)定，每次測(cè)定3例患者血清。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服傳統(tǒng)直接包被模式制備的食物過敏酶標(biāo)反應(yīng)板無法滿足患者個(gè)性化需求的不足，本發(fā)明引入生物素-鏈霉親和素間接包被模式，對(duì)酶標(biāo)反應(yīng)板的包被制作環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)。變應(yīng)原不需預(yù)先包被，而是標(biāo)記上生物素，與包被了親和素的微孔反應(yīng)板同時(shí)提供給檢測(cè)人員。檢測(cè)人員可以根據(jù)被檢者的具體情況靈活選擇所需食物變應(yīng)原，將生物素標(biāo)記變應(yīng)原和待測(cè)血清同時(shí)加入微孔板，實(shí)現(xiàn)即時(shí)包被，并且包被和檢測(cè)過程同步進(jìn)行，大大降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)靈活性，真正實(shí)現(xiàn)個(gè)性化檢測(cè)。

生物素(biotin，B)分子量為244.31，現(xiàn)已能人工合成，制備方便。生物素基本結(jié)構(gòu)為雙環(huán)結(jié)構(gòu)：I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親和素結(jié)合的部位；II環(huán)為噻吩環(huán)，含一個(gè)戊酸側(cè)鏈，其末端羧基可與生物大分子連接，形成生物素標(biāo)記抗原、抗體等。生物素與生物大分子結(jié)合后并不影響生物大分子和生物素原有的生物活性，即生物素標(biāo)記抗體同時(shí)具備與親和素和相應(yīng)抗原結(jié)合之特性。

鏈霉親合素(streptavidin，SA)，分子量65KD，由四條相同的肽鏈組成，一個(gè)鏈霉親合素分子能結(jié)合四個(gè)生物素分子。與親和素相比，鏈霉親和素對(duì)生物素具有高度親和力(親和常數(shù)為10¹⁵/mol)，與生物素結(jié)合后形成非常穩(wěn)定復(fù)合物，很難解離。基于生物素與鏈霉親和素相結(jié)合這一特性所建立的體系稱為生物素-親和素系統(tǒng)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種食物不耐受血清特異性IgG酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，主要包括：

(1)預(yù)包被生物素化牛血清白蛋白-鏈霉親和素的酶標(biāo)反應(yīng)板；

(2)生物素標(biāo)記的食物變應(yīng)原；

(3)生物素標(biāo)記抗人IgG抗體；

(4)人IgG標(biāo)準(zhǔn)品；

(5)陽(yáng)性質(zhì)控血清；

(6)酶標(biāo)記抗人IgG抗體

(7)常規(guī)酶標(biāo)清洗液

(8)顯色液A：含0.054％(V/V)H₂O₂的磷酸鹽檸檬酸緩沖液；

(9)顯示液B：含0.48g/L?TMB的檸檬酸緩沖液；

(10)終止液：1mol/L?H₂SO₄溶液。

本發(fā)明試劑盒的主要作用過程如下：