[發明專利]一種用于多不飽和脂肪酸生物合成的脫飽和酶Δ9 Des

在審

• 申請號: 201210310769.4
• 申請日: 2012-08-28
• 公開（公告）號: CN102787128A
• 公開（公告）日: 2012-11-21
• 發明（設計）人: 陳衛;陳海琴;顧震南;張灝;宋元達;趙建新;田豐偉;陳永泉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12N9/02;C12P7/64;C12R1/84
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 向華

技術領域

本發明涉及多不飽和脂肪酸（(Polyunsaturated?fatty?acids,PUFAs)的微生物制造領域，具體涉及在多不飽和脂肪酸生物合成途徑中起作用的脂肪酸脫飽和酶。?

背景技術

多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated?fatty?acids,PUFAs)是指含有兩個或兩個以上雙鍵、碳原子數為16～26的直鏈脂肪酸。其中，ω-3和ω-6是兩類人體所必需的脂肪酸，不能在體內合成，只能通過食物攝取。屬于ω-3的有：α-亞麻酸(ALA,18:3)、二十碳五烯酸(EPA,20:5)、二十二碳六烯酸(DHA,22:6)等；屬于ω-6的有：亞油酸(LA,18:2)、γ-亞麻酸(GLA,18:3)和花生四烯酸(ARA,20:4)等。多不飽和脂肪酸ω-3和ω-6在人體內有著多方面重要的生理功能，是所有細胞膜的重要組成成分，對激素代謝和許多酶的活性起調控作用，特別對新生兒腦和視力的發育是必需的。?

PUFAs的生物合成途徑是以硬脂酸(Stearic?acid)為底物，主要通過脂肪酸脫氫酶(Desaturase,Des)和延長酶(Elongase,Elo)的作用，生成不同的脂肪酸產物。主要的脂肪酸合成途徑有三條：Δ6脫氫酶-Δ6延長酶-Δ5脫氫酶-Δ5延長酶-Δ4脫氫酶途徑(Δ6?Des-Δ6?Elo-Δ5?Des-Δ5?Elo-Δ4?Des),?

Δ9延長酶-Δ8脫氫酶途徑(Δ9?Elo-Δ8?Des)和聚酮合成酶途徑(Polyketide?synthase,PKS)。研究PUFAs生物合成途徑中的關鍵酶和節點，對其合成通路進行解析和改造，對于PUFAs的微生物制造具有重要意義。?

高山被孢霉(Mortierella?alpina，M.alpina)是目前產PUFAs真菌中唯一具有正式安全性評估的菌種(GRAS)，其PUFAs含量極為豐富，總的脂肪含量達到菌體生物量的50%，其中ω-3達到總脂肪酸含量的3%，而ω-6?達到總脂肪酸含量的近30%，是名副其實的油脂細胞工廠。目前已有M.alpina菌株用于ω-6脂肪酸花生四烯酸(ARA,20:4)商業化生產的報道。已知M.alpina編碼1個c5，兩個c6,3個c9,1個c12和1個ω3區位選擇性脫氫酶，其具備所有已知的區位選擇性膜脫氫酶組。?

發明內容

膜脫飽和酶可以在多種宿主中表達，例如大腸桿菌、啤酒酵母、米曲酶和高山被孢霉。申請人已經對PUFAs生物合成途徑中的關鍵酶(ω3?Des、Δ12?Des和Δ9-I?Des)的高效表達、純化和鑒定進行了大量工作。具體地，申請人在M.alpina全基因組測序的基礎上，設計了三對分別針對編碼M.alpineΔ9?Des、Δ12?Des和ω3?Des這三個脫飽和酶的核苷酸的引物，具體引物序列在表1中列出。提取高山被孢霉RNA后進行反轉錄得到cDNA，用FF1和FR1、FF2和FR2、FF3和FR3三對引物PCR擴增出三條序列，將其插入pET19b(PP)并測序，進而亞克隆至畢赤酵母表達載體pPinkα-HC，構建上述三個脫飽和酶的表達載體，線性化后電轉化至pPink?strain2，得到的重組菌能夠順利表達上述三種脫飽和酶。酶學活性分析結果表明重組菌中的脫飽和酶能夠發揮功能，并用Ni柱一步層析法得到純化的脫飽和酶蛋白。?

本發明提供了編碼M.alpinaω3脫飽和酶(FADS15)和Δ9脫飽和酶(FADS9-I)的基因，其核酸序列分別如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:3所示。?

本發明還提供了分別含有SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:3的表達載體，能夠分別表達M.alpineω3脫飽和酶(FADS15)和Δ9脫飽和酶(FADS9-I)。優選地，所述表達載體是畢赤酵母表達載體。?

本發明還提供了一種重組微生物，它能夠分別表達M.alpinaω3脫飽和酶(FADS15)和Δ9脫飽和酶(FADS9-I)。優選地，所述重組微生物是重組畢赤酵母，包括PichiaPink?strain?1、PichiaPink?strain?2、PichiaPink?strain?3和PichiaPink?strain?4菌株，特別是PichiaPink?strain?2，其中含有攜帶SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:3的畢赤酵母表達載體。?