[發明專利]一種將固氮菌引入甘蔗組培苗的方法

無效

• 申請號: 201210310217.3
• 申請日: 2012-08-25
• 公開（公告）號: CN102960244A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 李楊瑞;邢永秀;魏春燕;楊麗濤;鄧智年;林麗;羅霆
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區農業科學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于植物組培技術領域，尤其涉及一種將固氮菌引入甘蔗組培苗的方法。?

背景技術

甘蔗健康種苗具有生長速度快、分蘗力強、成莖率高、產量高、用種量少等優點，是保證蔗糖業持續發展的重要措施之一。國家對甘蔗健康種苗的推廣也非常重視。2011年，國家農業部在廣西、云南、廣東和海南4省(區)啟動實施甘蔗健康種苗示范推廣工作。世界甘蔗生產大國如巴西、古巴、美國、澳大利亞等國90％蔗區實現了甘蔗生產用種健康種植，使得甘蔗優良品種的種性得以保持，其產量和質量得到進一步提高。據報道，巴西在生產上使用健康種苗可使甘蔗增產20％-40％(個別蔗區增產高達60％)(Urquiaga?et?al.，1992)。沈萬寬等(2009)報道，粵糖00-236健康種苗較其普通種莖苗蔗莖產量增產10.6％(小區試驗)和9.1％(大面積示范)，甘蔗蔗糖分提高0.26個百分點，且萌芽快，萌芽率較普通種莖苗提高22.94個百分點。楊本鵬等(2010)報道，種植脫毒健康種苗可以使甘蔗單位面積產量提高23.0％～40.2％，蔗糖分含量提高0.51％～1.01％絕對值。?

甘蔗作為世界主要的糖料和能源作物，氮肥的使用量對甘蔗的生產成本影響較大，若能降低氮肥的使用量，不僅可減少甘蔗的生產投入，也可減少對環境的污染。早在60年代，Dǒbereiner(1966)首次從甘蔗根部發現固氮菌后，甘蔗體內的固氮微生物種類越來越豐富，如例如醋酸桿菌、成團泛菌、草螺菌、克雷伯氏菌、巴西固氮螺菌、假單胞菌等(Cavalcante?et?al.，1988；Asis?et??al.，2000；Govindarajan?et?al.，2007；羅霆等，2010)。不同的甘蔗品種對接種的固氮菌的反應也不一樣，有些是固氮菌種類的差別引起的，有的則是由于其基因型以及環境條件的差別引起的。甘蔗生物固氮研究表明某些甘蔗品種獲得其氮素總量的30-70％左右，但是植物組織培養技術在去除一些病原微生物的同時，也會降低甘蔗體內的固氮菌數量，(Lima?et?al.，1987；Urquiaga?et?al.，1992)，若能在組培苗中接種固氮菌，對甘蔗健康種苗的推廣計劃則有更大推動作用。關于在甘蔗上接種固氮菌目前主要有兩種方法，一是種莖進行浸種處理，二是對組培苗進行接種處理。接種固氮菌能不同程度提高各品種器官中細菌的固氮酶活性，巴西固氮甘蔗品種表現出比廣西主栽甘蔗品種更強的固氮酶活性，且對接種固氮菌反應更敏感(林麗等，2008)歐陽雪慶等(2010)利用固氮菌液浸泡甘蔗單芽進行浸種處理，結果表明接種甘蔗內生固氮菌對甘蔗葉片硝酸還原酶活性和谷氨酰胺合成酶活性具有普遍而明顯的促進作用，而對谷草轉氨酶與谷丙轉氨酶的影響則因甘蔗品種差異表現出不同效果。黃杏等(2009)研究報道了接種固氮菌能夠提高甘蔗根系活力、蛋白質含量以及碳水化合物含量等。吳凱超等(2010)以傷口侵染法將菌液接種到甘蔗苗內發現，接種內生固氮菌可在不同程度上促進不同基因型甘蔗植株的生長，增加株高、莖徑、平均節間長度和單莖重。Reis等(2006)將生根后的組培苗分成單株，用剪刀剪傷根系，50毫升MS培養基，加入0.1ML10⁸-19CFU/ML培養好的菌液體，培養后發現接種處理可以提高甘蔗產量和氮肥利用率。?

生物標記是在基因表達定位、細菌接種植物后侵染植物過程以及在植物組織中定殖觀察的研究中非常有效的一種方法(Haseloff，et?al.，1998)。綠色熒光蛋白(GFP)基因是從水母Aquoria?victoria中克隆到的，它作為一種看得見的生物標記廣泛應用到基因表達和許多不同種類有機物的蛋白質亞細胞定位，在植物與根瘤菌以及植物與內生固氮菌的研究中有較好的應用(Singh?et?al.，2009)。?

克雷伯氏菌DX120是從廣西本地主栽品種新臺糖22(ROC22)中分離到的?一株具有高固氮活性的重要內生固氮菌，它可以在甘蔗組培苗的根中定殖并能進行固氮作用(林麗，2011)，揭示它具有較好的應用前景。本研究直接在甘蔗組培苗生根后，在液體培養基壯苗的同時，就接入一定量的固氮菌，簡化了接種方法。而且研究了DX120在不同的甘蔗品種以及接種更長時間定殖存活能力。因此我們設計了以DX120不同的菌液濃度接種兩種固氮能力不同甘蔗品種(B8和GT21)的組培苗后，研究它的定殖能力，以及同一接種濃度在不同時間和不同組培苗部位的菌群動態變化，探索一種較簡單的接種方法，同時比較不同菌液濃度對這兩種甘蔗品種組培苗的侵染和定殖能力差異，研究結果為進一步研究該固氮菌株與甘蔗的互作提供參考依據。?

發明內容