[發明專利]一種組織工程角膜的制備方法及其裝置

有效

• 申請號: 201210310206.5
• 申請日: 2012-08-28
• 公開（公告）號: CN102807965A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 盧永波
• 申請（專利權）人: 陜西瑞盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12M3/00;A61L27/38;A61L27/40
• 代理公司: 中國科學院西安專利中心 61001
• 代理人: 任越

1.一種組織工程角膜的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、接種羊膜上皮細胞：將哺乳動物源性的脫細胞角膜基質置于細胞培養皿中，將羊膜上皮細胞按1×10⁵～1×10⁶個/cm²的密度接種于脫細胞角膜基質的前彈力層表面；加入培養液A，于37℃條件下，在體積濃度分別為85％～93％的N₂、5％的CO₂和2％～10％的O₂環境中培養5～7天；每兩天換液，待羊膜上皮細胞于前彈力層表面生長匯合，得到復合羊膜上皮細胞的構建體；所述培養液A是以濃度為17.6g/L的MCDB153培養基水溶液為基液，內含有：表皮生長因子2μg/L、人胰島素10mg/L、L-谷氨酰胺2mM、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸鈉1.18g/L、花生四烯酸2mg/L、腺嘌呤10mg/L、三碘甲狀腺氨酸20ng/L、亞硒酸鈉5mg/L和轉鐵蛋白100mg/L；

步驟二、氣液交替培養上皮細胞膜片：將步驟一所得構建體的基質面與培養液A接觸培養；將羊膜上皮細胞面與培養液B間歇性接觸培養，即用培養液B培養10s后再暴露于空氣20s，如此反復循環12h；培養過程在光照條件下，37℃、體積濃度5％的CO₂環境中進行；

其中培養液B的組成是在純水中含：2～10μg/L的EGF，100～300ng/L轉化生長因子α，2～13μg/L轉化生長因子β₁，10～30μg/L維生素A，100～300mg/L維生素C，45μM酪氨酸，100～200μM谷胱甘肽，20～100mg/L葡萄糖，1～2mM氯化鈣，10～25g/L硫酸軟骨素，1～10g/L透明質酸，pH?7.2～7.4，滲透壓280～320mOsm/kg；

步驟三、角膜結構成熟培養：分別更換步驟二中的培養液A和培養液B，將步驟二所得構建體的基質面與培養液A接觸，將羊膜上皮細胞面與培養液B接觸，液下培養12h；培養過程在37℃、無光照條件下，體積濃度分別為85％～93％的N₂、5％的CO₂和2％～10％的O₂的混合氣體環境中進行；

將步驟二與步驟三交替進行，每12小時交替一次，培養持續10～15天，最終得到結構進一步成熟的組織工程角膜。

2.一種制備權利要求1所述組織工程角膜的角膜雙面培養裝置，其特征在于，所述培養裝置由下至上依次為底盒、固定卡環、托盒、盒蓋；底盒呈圓形盒狀；托盒外底部有三個支腿，托盒高度小于底盒高度，能置于底盒內，托盒中心開有通孔，通孔直徑與所培養角膜相適應；固定卡環內徑與托盒通孔直徑一致，固定卡環與托盒外底部能夠通過旋卡方式固定；盒蓋能與底盒匹配扣合，盒蓋上設置有一進出液管直插底盒內底，再設置一進出液三通管，該三通管的一端在盒蓋外，另兩端通向托盒內底兩側。