[發(fā)明專(zhuān)利]診斷細(xì)粒棘球蚴病的重組抗原蛋白、其制備方法和用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210309286.2
• 申請(qǐng)日: 2012-08-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102863524A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹建平;王瑩;沈玉娟;袁忠英;周何軍;徐馀信;張璟;王燕娟;伍衛(wèi)平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/435
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/435;C12N15/11;C12N15/12;C12N15/70;C12Q1/68;G01N33/68
• 代理公司: 上海浦一知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

1.一種診斷細(xì)粒棘球蚴病的重組抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

2.一種用于診斷細(xì)粒棘球蚴病的引物，其特征在于，其序列為：

上游：5'-GTAGAATTCATGTCCATCTTAAAGATCC-3'（如SEQ?ID?NO:3所示）或其互補(bǔ)鏈；

下游：5'-ATACTCGAGTTACAAAGGATTGCGGAAG-3'（如SEQ?ID?NO:4所示）或其互補(bǔ)鏈。

3.一種如權(quán)利要求1所述的診斷細(xì)粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）EgENO基因擴(kuò)增，EgENO基因擴(kuò)增的具體序列如SEQ?ID?NO:2所示；

2）重組質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定，采用的重組質(zhì)粒載體為：PET28a(+)；

3）重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化。

4.如權(quán)利要求3所述的診斷細(xì)粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟1）具體為：設(shè)計(jì)SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈為引物，抽取細(xì)粒棘球蚴總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

5.如權(quán)利要求4所述的診斷細(xì)粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，所述RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

6.如權(quán)利要求3所述的診斷細(xì)粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟2）具體為：將步驟1）所得的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體PET28a(+)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選菌落、培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定并測(cè)序，將測(cè)序無(wú)誤的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）。

7.如權(quán)利要求3所述的診斷細(xì)粒棘球蚴病的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟3）具體為：將重組菌接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集誘導(dǎo)前及不同誘導(dǎo)時(shí)間菌液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析；離心收集菌體，用純化緩沖液重懸，冰浴，后冰上超聲裂解，離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行可溶性分析；按純化試劑盒純化重組蛋白，測(cè)定吸光度計(jì)算蛋白濃度并用SDS-PAGE鑒定其純度。

8.一種如權(quán)利要求1所述的重組抗原蛋白在制備診斷細(xì)粒棘球蚴病藥物中的應(yīng)用。

9.一種如權(quán)利要求1所述的重組抗原蛋白在制備細(xì)粒棘球蚴病診斷試劑盒中的應(yīng)用。