[發(fā)明專(zhuān)利]一株阿魏酸酯酶生產(chǎn)菌株及應(yīng)用該菌株生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210307546.2
• 申請(qǐng)日: 2012-08-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102796673A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐澤平;馬韻升;史慶苓;楊傳倫;張心青;王秀芝;付慧君;虞鳳慧
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 黃河三角洲京博化工研究院有限公司;山東京博控股股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/14
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/14;C12N9/18;C12R1/885
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 苗峻

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一株高產(chǎn)阿魏酸酯酶的微生物菌株，特別涉及一株綠木霉及利用該菌生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法。?

背景技術(shù)

阿魏酸酯酶也被稱(chēng)為肉桂酸酯酶，是羧酸酯水解酶的一個(gè)亞類(lèi)，也是一種胞外酶，它可以水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來(lái)。阿魏酸在植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中起著重要的作用，它可以在植物細(xì)胞壁的木質(zhì)素與木質(zhì)素之間，木質(zhì)素與半纖維素之間，半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而構(gòu)成一個(gè)骨架結(jié)構(gòu)，使得整個(gè)細(xì)胞壁變得堅(jiān)硬。阿魏酸酯酶可以打開(kāi)細(xì)胞壁木質(zhì)素中阿魏酸、對(duì)香豆酸及二聚阿魏酸等分子與半纖維素支鏈形成的致密網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從空間上對(duì)細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解，因此阿魏酸酯酶已被推測(cè)認(rèn)為是消除細(xì)胞壁降解限制因子的關(guān)鍵酶之一。?

在造紙工業(yè)中，經(jīng)阿魏酸酯酶處理的原料，木質(zhì)素更容易脫除，可減少制漿工序的化學(xué)藥品用量。而纖維細(xì)胞壁經(jīng)阿魏酸酯酶處理后，表面變得疏松，成紙時(shí)可以提高紙品的機(jī)械強(qiáng)度。利用阿魏酸酯酶處理紙漿后產(chǎn)生的阿魏酸可作為優(yōu)質(zhì)的抗氧化劑，除此之外，阿魏酸還具有的抗腫瘤、消炎、促進(jìn)傷口愈等保健作用，所以阿魏酸可作為功能因子開(kāi)發(fā)功能性的食品。同時(shí)，阿魏酸可以作為合成天然香蘭素的前體，以阿魏酸為原料，利用微生物的方法生產(chǎn)的香蘭素與合成的香蘭素相比具有毒性低，安全性高的特點(diǎn)，可以用作食品和化妝品行業(yè)的香料。?

專(zhuān)利CN200810056477.6公開(kāi)了一種阿魏酸酯酶的提取方法，但操作較為復(fù)雜，關(guān)于阿魏酸酯酶的研究，有很多問(wèn)題需要解決，主要是目前篩選出的分泌阿魏酸酯酶的微生物的分泌量仍然達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)阿魏酸酯酶的要求；其次，阿魏酸酯酶提取方法有待改進(jìn)，其工業(yè)化生產(chǎn)受到限制。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)存在的不足，提供一種利用綠色木霉（Trichoderma?viride）通過(guò)液體發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸酯酶的方法，收率較現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道提高了數(shù)倍，所采用的菌株代碼為JBSH-OO1，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC?No.5612；該菌株可應(yīng)用于生產(chǎn)阿魏酸酯酶，該方法發(fā)酵所得阿魏酸酯酶酶活可達(dá)200mU/ml以上,純化后的阿魏酸酯酶酶活可達(dá)50000mU/g以上。?

本發(fā)明提供的具體技術(shù)方案是：?

首先獲得了一株新的菌株，該菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為CGMCC?No.5612，其具體獲得方法如下：?

（1）出發(fā)菌株：以本實(shí)驗(yàn)室收藏的各種菌株作為起始菌株，其中包括多種木腐菌、軟腐菌、枯萎菌和其他霉菌，分類(lèi)培養(yǎng)建立菌種庫(kù)。?

（2）篩選方法：以阿魏酸甲酯作為唯一碳源制備平板培養(yǎng)基，接入上述菌?株在適宜條件下培養(yǎng)，根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈進(jìn)行一級(jí)篩分。初步篩選具有產(chǎn)阿魏酸酯酶能力的菌株，然后對(duì)初篩菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，根據(jù)液體培養(yǎng)物中阿魏酸酯酶的活性大小篩選出其中的2株產(chǎn)酶活性最高的菌株作為馴化菌株。?

（3）對(duì)2株待馴化菌株的生理生化特性、產(chǎn)酶性能等進(jìn)行比較深入研究，最終篩選出一株產(chǎn)酶能力強(qiáng)、易于培養(yǎng)并具有穩(wěn)定的傳代特性的菌株，將其初步命名為JBSH01。?

（4）以該菌株為出發(fā)菌株，采用常規(guī)誘變方法，如UV，DMS，MMS，NTG等，結(jié)合低能離子注入法，反復(fù)多次誘變，復(fù)篩，最終獲得了高產(chǎn)菌株JBSH-001。?

發(fā)明人對(duì)該菌株在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員普通微生物中心進(jìn)行了生物保藏，保藏編號(hào)為CGMCC?No.5612，經(jīng)檢測(cè)其為存活狀態(tài)。?

上述JBSH-001菌株，其形態(tài)特征如下：?

菌絲纖細(xì)無(wú)色，具分隔，多分枝。分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，對(duì)生或互生，一般有2-3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形。分生孢子多為球形，孢壁具小疣突，綠色。在PDA培養(yǎng)基上菌落初為白絮狀，后為暗綠色。上述形態(tài)特征與綠色木霉Trichoderma?viride的培養(yǎng)特性一致。?

發(fā)明人同時(shí)對(duì)其進(jìn)行了16S?rDNA測(cè)序，其基因序列如Seq?ID?No:1所示，該序列為菌株JBSH-OO1的16S?rDNA的全序列。?

用所測(cè)得的16S?rDNA序列進(jìn)行BLSTN比對(duì)，結(jié)果顯示，菌株JBSH-OO1的16S?rDNA的核苷酸序列與木霉屬Trichoderma?spp.不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性，與其中明確標(biāo)記為綠色木霉Trichoderma?viride的5株菌株有100%的同源性，因而進(jìn)一步確定本發(fā)明所提供的菌株為一株綠色木霉菌株。?