[發明專利]一種檢測干細胞注射液中細菌的方法

有效

• 申請號: 201210306849.2
• 申請日: 2012-08-27
• 公開（公告）號: CN102808032A
• 公開（公告）日: 2012-12-05
• 發明（設計）人: 劉擁軍;朱德琳;陳博;徐萌
• 申請（專利權）人: 天津和澤干細胞科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測干細胞注射液中細菌的方法，其特征是采用實時熒光定量PCR熒光探針技術檢測干細胞注射液中的細菌，上下游PCR引物及熒光探針序列與細菌16S?rDNA序列的保守區域互補。

2.根據權利要求1的方法，其能夠在3小時內完成對常見的革蘭氏陰性細菌和陽性細菌的檢測。

3.根據權利要求1的方法，所述干細胞注射液為人臍帶間充質干細胞抗肝纖維化注射液。

4.根據權利要求1的方法，其中上下游PCR引物及熒光探針序列分別為SEQ?ID?NO：1、2和3。

5.根據權利要求1-4任一項的方法，其包括以下步驟：

(1)供試品處理：干細胞注射液混勻取1ml轉移到1.5ml離心管中，4000-6000r/m離心8-12min，取上清到新的離心管中，12000-14800r/m離心5-10min，棄上清，加100-1000μl無菌的去離子水重懸，再12000-14800r/m離心5-10min，再次棄上清，各加100-1000μl無菌的去離子水重懸，再12000-14800r/m離心5-10min，棄上清加10μl無菌的去離子水重懸，取其中5μl做供試品模板；

(2)陽性對照的處理：大腸桿菌經過發酵過夜，用無菌的去離子水稀釋大腸桿菌菌液濃度為2?cfu?/μl，取其中5μl做陽性對照模板；

(3)陰性對照的處理：取5μl無菌的去離子水做陰性對照模板；

(4)陽性干擾品的處理：干細胞注射液混勻取1ml上清到1.5ml離心管中，同時加入10μl濃度為2?cfu/μl大腸桿菌菌液，4000-6000r/m離心8-12min，取上清到新的離心管中，12000-14800r/m離心5-10min，棄上清，加100-1000μl無菌的去離子水重懸，再12000-14800r/m離心5-10min，再次棄上清，加100-1000μl無菌的去離子水重懸，再12000-14800r/m離心5-10min，棄上清加10μl無菌的去離子水重懸，取其中5μl做陽性干擾品模板；

(5)擴增檢測：在熒光定量PCR儀上進行，總反應體積為20μl，其中模板5μl，10μM的上下游引物各1μl，2μM的探針1μl，PCR預混液4μl，剩下的用無菌的去離子水補齊；反應條件為：①50℃?2min；②95℃?10min預變性；③95℃?15?sec?，60℃?1min為一個循環，共40次循環；④40℃?1?sec；

(6)結果判斷：通過比較供試品、陽性對照、陰性對照以及陽性干擾品的Ct值確定供試品中是否含有細菌。

6.根據權利要求5的方法，其中如果陽性干擾品的Ct值和陽性對照的Ct值接近，則說明供試品的處理過程不會導致假陰性的產生。

7.根據權利要求5或6的方法，其中結果判斷的標準為：①Ct值≥40.0的標本為陰性；②Ct值≤35.0的標本，檢測結果為陽性；③Ct值在35.0-40.0之間為灰色區域，供試品的Ct值≤陽性對照的Ct值，檢測結果為陽性；供試品的Ct值≥陰性對照的Ct值，檢測結果為陰性。

8.用于權利要求1-7任一項的方法的試劑盒，其包括定量PCR反應液、陰性對照和陽性對照，其中PCR反應液由PCR預混液、細菌檢測上游PCR引物、下游PCR引物及熒光探針組成。

9.根據權利要求8的試劑盒，其中上下游PCR引物及熒光探針序列分別為SEQ?ID?NO：1、2和3。

10.權利要求1-7任一項的方法在干細胞注射液早期無菌檢測中的應用。