[發明專利]一種用生物技術生產中藥材原料丹參酮的方法

無效

• 申請號: 201210306593.5
• 申請日: 2012-08-27
• 公開（公告）號: CN103627722A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 王文杰
• 申請（專利權）人: 王文杰
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體說，是涉及一種利用基因工程技術，用雙關鍵酶基因共轉化提高丹參毛狀根丹參酮含量的方法。

背景技術：

心腦血管疾病與糖尿病、癌癥等是目前對人類威脅最大的三大類疾病，其中心腦血管疾病位于這三大疾病之首。據統計，全世界每年大約有1700萬人死于心腦血管疾病，約占全球總死亡人數的1/3；我國每年大約有260萬人死于心腦血管疾病，心腦血管疾病已成為威脅人們健康的“頭號殺手”。因此研究開發高效、低毒和廉價的治療心腦血管疾病藥物具有十分重要的意義。

中藥丹參系唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia?miltiorrhiza?Bunge)的干燥根及根莖，因其色紅且形狀似參而得名“丹參”，是一種主治心血管系統疾病的常用中藥。丹參作為一種傳統中藥材在我國沿用已久，具有祛瘀止痛、活血通經、清心除煩、養血安神的作用，主治冠心病、心絞痛、心煩不眠、痛經等病癥。研究表明丹參活性成分主要分為兩大類：即脂溶性二萜類化合物(丹參酮I、丹參酮IIA、隱丹參酮、二氫丹參酮等)和水溶性酚酸類化合物(丹酚酸A、丹酚酸B、紫草酸、丹參素等)，還含黃酮類，三萜類甾醇等其他成分。

現代研究表明丹參對心血管系統疾病療效比較顯著，以丹參為主的多種復方制劑如復方丹參注射液、復方丹參片、復方丹參膠囊等，被廣泛用于治療心血管疾病、腎病、肝病及抗感染等。最新科學研究還表明丹參所含的丹參酮類物質具有抗腫瘤，抗菌消炎，抗動脈粥樣硬化等多種藥理活性，在臨床上用途廣泛。

但是由于丹參為多年生草本植物，生長周期較長，藥用活性成分含量較低，品質退化，而且選育成本很高，野生資源日益減少。丹參酮的結構復雜，化學合成過程十分繁瑣，成本較高且易造成環境污染；在離體條件下的細胞培養獲得的細胞活性成分積累量低而且穩定性較差。以上種種原因，造成丹參丹參酮藥源緊缺，而基因工程的快速發展與毛狀根培養技術的日益成熟，為提高丹參毛狀根中丹參酮成分的含量和產量，提供了一條嶄新的途徑。

丹參酮類化合物(如丹參酮I、丹參酮IIA、二氫丹參酮及隱丹參酮等)屬于二萜類化合物，最新研究表明不論是甲羥戊酸(MVA)途徑還是1-去氧木糖-5-磷酸(DXP)途徑都可以為萜類物質(包括丹參酮)的生物合成提供前體物質。3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶基因(SmHMGR)和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶基因(SmDXR)是丹參酮生物合成途徑中的兩個關鍵限速酶基因，它們分別位于細胞質的MVA途徑以及細胞質體內的DXP途徑中，是丹參酮代謝工程的重要靶點。本發明采用基因工程手段，將上述的兩個關鍵酶基因SmHMGR和SmDXR插入植物表達載體，通過發根農桿菌轉化丹參毛狀根。通過上述工藝優化丹參酮生物合成途徑，獲得高產丹參酮的毛狀根，并進行大規模培養，大大提高了丹參酮產量。

發明內容：

本發明包括如下具體步驟：

(1)將丹參3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因SmHMGR和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶基因SmDXR插人植物表達載體，構建重組載體；

(2)將含有丹參3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因SmHMGR和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶基因SmDXR基因的重組載體轉入發根農桿菌，構建含有重組載體的發根農桿菌；

(3)用所得含有重組載體的發根農桿菌介導丹參3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因SmHMGR和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶基因SmDXR轉化丹參。將含有重組載體的發根農桿菌與丹參外植體幼嫩葉片共培養，長出毛狀根后除菌；

(4)收獲的轉基因丹參毛狀根經烘干研磨，萃取，超聲，離心，真空干燥，過濾等步驟處理后，取樣加入高效液相色譜儀。通過高效色譜法測定丹參轉基因毛狀根中丹參酮含量，篩選獲得含量高的株系。

具體實施方式：

下面結合具體實施例詳細闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆建議的條件。

實施例1

SmHMGR和SmDXR雙基因片段的構建

1.1丹參總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

將鮮重量0.1g丹參轉基因毛狀根用RNA試劑盒提取總RNA并在分光光度計上測定相關的吸光值，計算所提取RNA的純度及濃度。以0.5ug?RNA為起始量，用反轉錄酶進行第一鏈cDNA的合成。

1.2SmHMGR和SmDXR雙基因片段的獲得