[發(fā)明專利]一種檢測砷生物可利用度的微生物細胞傳感器

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210306035.9
• 申請日: 2012-08-24
• 公開（公告）號: CN102796693A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 莊國強;侯啟會;馬安周
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12Q1/66;C12Q1/02;G01N21/64;C12R1/19
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測水體及土壤中砷生物可利用度的微生物細胞傳感器的搭建及使用。

背景技術(shù)

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，砷及其化合物的污染形勢日益嚴(yán)峻，已被WHO評定為水體中最嚴(yán)重的重金屬污染物之一。砷及其化合物可造成人體心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)等全面的危害。對砷污染環(huán)境進行合理、準(zhǔn)確的監(jiān)測是開展污染防治工作的重要前提。

目前監(jiān)測和檢測重金屬污染物主要有兩種方法：一種是物理化學(xué)分析法，如電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)、電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)等，其優(yōu)點是具備高檢測靈敏度和高特異性，但也存在一些不足，如儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，檢測周期長，最重要的一點是，傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法主要是對環(huán)境重金屬總量進行測定，不能檢測重金屬的生物可利用度；另一種方法是基于生物有機體的生物傳感器，其優(yōu)勢是可以直接反映污染物對生物有機體的毒性及影響。微生物細胞具有易操作，繁殖及生存能力強，易儲存和穩(wěn)定性高的特點，以微生物細胞為生物學(xué)感應(yīng)元件的微生物細胞傳感器可以極大簡化傳感器的制作過程，提高傳感器的檢測效率。

微生物細胞傳感器的微生物細胞含有一個由特異調(diào)控蛋白基因和報告基因組成的重組質(zhì)粒。當(dāng)宿主細胞的生長環(huán)境中有重金屬離子存在時，宿主細胞通過不同的機制吸收重金屬離子。當(dāng)重金屬離子進入到胞內(nèi)后，重組質(zhì)?；蛩拗魅旧wDNA編碼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白被重金屬離子特異激活，與啟動子綁定或從啟動子上脫落，激活(“turn?on”)或抑制(“turn?off”)啟動子的啟動，進而調(diào)控下游報告基因表達，產(chǎn)生可檢測的信號，這種信號的變化強度與重金屬誘導(dǎo)物的濃度密切相關(guān)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白對重金屬離子的識別能力和綁定能力決定著微生物全細胞傳感器的檢測特異性和靈敏度。微生物細胞傳感器已成為重金屬生物可利用度監(jiān)測和風(fēng)險污染評價的重要工具。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的化學(xué)檢測方法不能反映砷的生物可利用度且存在操作復(fù)雜、儀器價格昂貴等問題，利用大腸桿菌砷抗性操縱子ars啟動子序列、調(diào)控蛋白基因arsR和商業(yè)化質(zhì)粒pEGMluc的熒光素酶報告基因(luc)，構(gòu)建出的一種微生物細胞傳感器，從而提供一種具有高靈敏度、低成本的砷生物可利用度檢測方法。

構(gòu)建該細胞傳感器的具體操作步驟為：

1、T7啟動子和報告基因的拼接

以商業(yè)化質(zhì)粒載體pRSET?A.B.C為模板，PCR擴增得到T7啟動子片段fl；以商業(yè)化質(zhì)粒載體pGEM-luc為模板，PCR擴增得到熒光素酶報告基因luc片段f2；將片段f1和f2按一定比例混合，以混合液為模板，PCR擴增得到T7啟動子和報告基因luc的拼接片段f3；

2、包含T7啟動子的報告基因?qū)雙UC18質(zhì)粒：

對pUC18質(zhì)粒用SacI與BamHI進行雙酶切處理后純化得到載體v1；對拼接序列f3用SacI與BamHI進行雙酶切處理后純化得到片段f4；將片段f4連入載體v1，利用大腸桿菌作為宿主進行轉(zhuǎn)化，得到含有T7啟動子和報告基因luc的載體v2；

3、載體v2中l(wèi)ac啟動子的去除

以pUC18為模板，擴增得到不含lac啟動子的pUC18部分序列f5；對f5用SacI和HindIII進行雙酶切處理后純化得到片段f5′；對載體v2用SacI利HindIII進行雙酶切處理后純化得到載體v3；將片段f5′連入載體v3，利用大腸桿菌作為宿主進行轉(zhuǎn)化，得到含有T7啟動子和報告基因luc且去除lac啟動子的載體v4；

4、載體v4與T7終止子的拼接：

以pET30a為模極，擴增得到T7終止子片段f6；對片段f6用BamHI和HindIII進行雙酶切處理后純化得到片段f6′；對載體v4用BamHI和HindIII進行雙酶切處理后純化得到載體v5；將片段f6′連入載體v5，利用大腸桿菌作為宿主進行轉(zhuǎn)化，得到受T7啟動子誘導(dǎo)表達的基礎(chǔ)型傳感器細胞；

5、基礎(chǔ)型傳感器的表達能力驗證：

用2mM的IPTG誘導(dǎo)基礎(chǔ)型傳感器細胞，采用Varioskan?Flash全波長掃描多功能酶標(biāo)儀檢測其發(fā)射光譜以驗證基礎(chǔ)型傳感器細胞對報告基因的表達能力。

6、目標(biāo)質(zhì)粒的構(gòu)建