[發明專利]核酸探針在片延伸基因芯片及制備工藝和使用方法

無效

• 申請號: 201210305021.5
• 申請日: 2012-08-23
• 公開（公告）號: CN102827764A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 趙雨杰;何群;趙書陽;潘忠誠;王天驕;王紹成;鐘連聲;馬汝海;張玉魁
• 申請（專利權）人: 趙雨杰
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12Q1/68;C40B40/06;C40B50/14
• 代理公司: 沈陽智龍專利事務所(普通合伙) 21115
• 代理人: 宋鐵軍;周楠

技術領域

本發明主要涉及一種核酸探針在片延伸基因芯片及其制備工藝和使用方法，屬于生物技術領域，特別是基因芯片領域。?

背景技術

基因芯片技術在醫學、生命科學、藥業、農業、環境科學等凡與生命活動有關的領域中均具有重大的應用前景。陣列型基因芯片技術可廣泛應用于疾病診斷、藥物基因組圖譜、篩選、中藥物種鑒定、農作物的優育優選、司法鑒定、食品衛生監督、環境檢測、國防等許多領域。它將為人類認識生命的起源、遺傳、發育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設計和藥物開發中先導化合物的快速篩選和藥物基因組學研究提供技術支撐平臺。國內外研究結果表明：傳統基因芯片將寡核酸探針固定在芯片載體表面的雜交動力學表現與核酸在溶液中的表現明顯不同，實驗結果很難解釋，甚至互相矛盾。主要原因是表觀反應速率不僅與探針的密度、探針的長度、探針在互補序列上的位置、溶液擴散速度、載體表面物理性狀、環境溫度、離子強度及種類有關，還受其他重要因素的影響。?

科學家們發現，基因芯片雜交結果的重現性仍然不是十分理想，一般情況下，中高密度基因芯片雜交結果的重現性在85%左右。Zhang?L等使用從同一標本中提取mRNA用Affymetrix公司生產的U133A?Gene和U133?Plus2.0芯片進行參照雜交，雜交實驗獲得的結果相當不一致，兩個芯片雜交結果比較，將近70%檢測相同基因的探針陣列點雜交信號數值出現明顯偏差，他們認為通過比?較兩種芯片雜交結果，無法確定哪個結果能夠準確反映生物樣本中基因表達水平。利用OWLS(optical?waveguide?lightmode?spectroscopy,OWLS)非標記檢測技術，在實驗過程中觀測到當靶核酸序列長于探針序列時，靶序列及其與探針雜交后的游離端在溶液中會形成立體結構，而具有立體結構的靶序列分子的熱力學擴散運動，不僅影響雜交體的形成，還會使雜交體的解離常數增加，甚至使雜交體不能穩定存在。靶序列分子游離端熱力學運動是影響雜交動力學的重要因素。雜交結果重復性較差這一瓶頸問題限制了基因芯片技術的發展。?

前期研究發現，核酸在固液界面，尤其是當固定在芯片表面的核酸探針長度短于核酸靶序列長度情況下，雜交動力學行為有悖于Southern理論。?

為了實現核酸探針在片延伸，提高基因芯片檢測的重復性和單堿基變異檢測的特異性，應該構建具有PCR擴增、探針延伸、熒光標記、雜交、清洗和檢測功能的核酸探針在片延伸基因芯片。采用核酸探針在片延伸技術在延伸核酸序列時，可以實現等位基因特異性PCR（allele?specific?PCR），針對單堿基變異（包括SNPs）進行分析。傳統的基因芯片通過互補序列雜交的方式檢測待檢樣品的核酸序列，對單堿基變異識別能力較差。如果通過改變現有基因芯片工作原理，研制核酸探針在片延伸基因芯片，可以利用等位基因特異性PCR技術原理提高基因芯片識別單堿基變異的能力。?

發明內容

發明目的?

本發明設計了一種核酸探針在片延伸基因芯片及制備工藝和使用方法，在該芯片上能夠實現核酸探針在片延伸，其目地在于提供一種高通量、高重復性、高準確性的基因序列檢測技術及裝置。?

技術方案?

一種核酸探針在片延伸基因芯片，包括芯片本體，其特征在于：芯片本體上具有微池，芯片本體一側為蓋玻片，芯片本體與蓋玻片之間設有密封圈，芯片本體上方設有壓蓋，芯片本體另一側設有兩個閥門，在微池的兩端分別設有閥門的流入道和流出道；核酸探針微陣列固定于蓋玻片內表面的微池覆蓋范圍內，蓋玻片、密封圈與芯片本體的微池形成密閉的PCR反應室，蓋玻片構成透明的一側薄室壁。?

微池的容積為20-50μl，微池具有快速變溫的薄壁結構。?

該芯片在玻璃基片上分布有多個不同區域的微陣列，在每個微陣列區域中，分別固定識別不同基因序列的特異性探針和等位基因鑒別探針，同時另設有質控探針和陣列位置指示探針；利用DNA聚合酶特異性延伸的特性，在基因芯片表面進行核酸探針特異性延伸，實現完全互補核酸探針在片延伸。?

一種如上所述核酸探針在片延伸基因芯片的制備工藝，其特征在于：步驟如下：?

（1）芯片本體制備：選用熱變形溫度≥140℃注塑材料，制做基因芯片本體；?

（2）密封圈制備：制做環形密封圈；?

（3）設計探針和引物：從NCBI等數據庫獲得基因芯片設計需要的基因序列，利用生物信息學生物軟件設計引物和特異性的探針；?