[發(fā)明專(zhuān)利]一種腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品各群游離多糖含量的測(cè)定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210304912.9
• 申請(qǐng)日: 2012-08-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102809656A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-12-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃鎮(zhèn);吳凱;樊會(huì)蘭;張勝祥;馬波;陳磊;白梅;金棟;郭秋岑;熊波;胡東梅;王會(huì)梅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 云南沃森生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/561
• 代理公司: 昆明合眾智信知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 53113
• 代理人: 康珉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品各群游離多糖含量的測(cè)定方法。?

背景技術(shù)

奈瑟氏腦膜炎球菌（n.meningitidis），簡(jiǎn)稱(chēng)腦膜炎球菌，腦膜炎球菌感染是引起兒童細(xì)菌性腦膜炎的常見(jiàn)病因，病死率較高。由于腦膜炎球菌莢膜多糖疫苗的使用，有效地控制了發(fā)病率。但是，莢膜多糖屬T細(xì)胞非依賴(lài)性抗原，再次免疫不能被加強(qiáng)，且不能誘導(dǎo)2歲以下兒童產(chǎn)生免疫應(yīng)答，有一定的局限性。以化學(xué)方法將蛋白載體共價(jià)結(jié)合到莢膜多糖上，可以使之成為T(mén)細(xì)胞依賴(lài)型抗原，從而具有免疫記憶反應(yīng)，因此對(duì)5歲以下嬰幼兒提供免疫保護(hù)。

研究表明，A群腦膜炎球菌多糖—白喉毒素?zé)o毒變異蛋白結(jié)合物、C群腦膜炎球菌多糖—白喉毒素?zé)o毒變異蛋白結(jié)合物、Y群腦膜炎球菌多糖—白喉毒素?zé)o毒變異蛋白結(jié)合物、W135群腦膜炎球菌多糖—白喉毒素?zé)o毒變異蛋白結(jié)合物在小鼠中具有很強(qiáng)的免疫原性，可刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IgG，而單獨(dú)的莢膜多糖不能刺激小鼠產(chǎn)生抗體或僅有低水平抗體產(chǎn)生。可見(jiàn)結(jié)合物中真正起作用的是與白喉毒素?zé)o毒變異蛋白結(jié)合的多糖，多糖結(jié)合疫苗中的游離多糖含量超過(guò)規(guī)定的限度會(huì)對(duì)疫苗臨床使用的效果產(chǎn)生不利的影響，因此多糖蛋白結(jié)合物中游離多糖含量測(cè)定是多糖結(jié)合疫苗質(zhì)量控制中的關(guān)鍵指標(biāo)之一，也是反映結(jié)合疫苗質(zhì)量的優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一。

因?yàn)椴煌?xì)菌莢膜多糖以及不同多糖結(jié)合物性質(zhì)差異較大，對(duì)于單獨(dú)結(jié)合物原液中游離多糖含量，A群可采用冷酚處理后通過(guò)測(cè)定磷含量獲得，C、Y或W135群也可采用冷酚處理后通過(guò)測(cè)定唾液酸含量獲得；A+C結(jié)合疫苗各群游離多糖含量也可分別通過(guò)前述測(cè)A群的磷含量和C群的唾液酸含量而獲得，而在A、C、Y、W135群結(jié)合疫苗成品中A、C、Y、W135群結(jié)合物混合在一起，且C、Y、W135群均含有唾液酸，故無(wú)法通過(guò)測(cè)唾液酸含量獲得C、Y、W135各群游離多糖含量，由于在生產(chǎn)3個(gè)群以上的多糖結(jié)合疫苗成品過(guò)程中存在諸多影響因素，且A、C、Y或W135群游離多糖的穩(wěn)定性各不相同，而各群游離多糖含量的高低與結(jié)合疫苗成品中對(duì)應(yīng)群抗原對(duì)機(jī)體免疫原性的好壞密切相關(guān)，從而影響最終產(chǎn)品的免疫保護(hù)效果，故需要對(duì)A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品各群游離多糖含量進(jìn)行分別測(cè)定，以保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量。

《火箭免疫電泳法定量檢測(cè)4價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗中C群腦膜炎球菌多糖含量的方法學(xué)驗(yàn)證》（林云等，發(fā)表國(guó)際生物制品學(xué)雜志2008年12月第31卷第6期）中介紹了一種檢測(cè)4價(jià)腦膜炎球菌多糖疫苗中C群腦膜炎球菌多糖含量的方法，解決了測(cè)定A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖疫苗成品各群多糖含量的技術(shù)問(wèn)題，但該方法不適用于測(cè)定結(jié)合疫苗成品中各群多糖含量，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)證明，結(jié)合疫苗中各群結(jié)合物的載體蛋白會(huì)對(duì)火箭免疫電泳產(chǎn)生影響，導(dǎo)致結(jié)果不能真實(shí)準(zhǔn)確地反映多糖含量，故3個(gè)群以上的多糖結(jié)合疫苗成品包括A、C、Y、W135群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗成品各群游離多糖含量的測(cè)定是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)，目前尚無(wú)該類(lèi)多糖結(jié)合疫苗成品各群游離多糖含量測(cè)定的通用方法，需建立一種方法準(zhǔn)確測(cè)定該類(lèi)多糖結(jié)合疫苗成品中A、C、Y、W135等各群的游離多糖含量。

抗原抗體反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。?這種反應(yīng)即可在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行，也可以在機(jī)體外進(jìn)行。抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)主要有三性：即特異性、比例性、可逆性。?特異性，是抗原抗體反應(yīng)的最主要特征，這種特異性是由抗原決定簇和抗體分子的超變區(qū)之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性確定的。這種高度的特異性在傳染病的診斷與防治方面得到有效的應(yīng)用。隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，還將在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域得到更加深入和廣泛的應(yīng)用，比如腫瘤的診斷和特異性治療等。?比例性，是指抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系，只有當(dāng)二者濃度比例適當(dāng)時(shí)才出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)，在抗原抗體比例相當(dāng)或抗原過(guò)剩或抗體過(guò)剩的情況下，反應(yīng)最徹底，形成的免疫復(fù)合物沉淀最多、最大。而當(dāng)抗原抗體比例超過(guò)此范圍時(shí)，反應(yīng)速度和沉淀物量都會(huì)迅速降低甚至不出現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)。?可逆性，是指抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離恢復(fù)為抗原與抗體的特性。由于抗原抗體反應(yīng)是分子表面的非共價(jià)鍵結(jié)合，所形成的復(fù)合物并不牢固，可以隨時(shí)解離，解離后的抗原抗體仍保持原來(lái)的理化特征和生物學(xué)活性。