[發明專利]一種青鳉魚卵巢結構蛋白基因啟動子及其應用有效

申請號：	201210304159.3	申請日：	2012-08-23
公開（公告）號：	CN102936596A	公開（公告）日：	2013-02-20
發明（設計）人：	胡建英;趙硯彬;夏爽;蔣潔瓊	申請（專利權）人：	北京大學
主分類號：	C12N15/113	分類號：	C12N15/113;C12N15/63;C12N1/21;C12N15/85;A01K67/027;G01N33/68;C12R1/19
代理公司：	北京君尚知識產權代理事務所(普通合伙) 11200	代理人：	余長江
地址：	100871***	國省代碼：	北京;11
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種魚卵結構蛋白基因啟動子及其應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及動物基因工程技術，特別涉及一種來自青鳉魚卵巢結構蛋白(OSP1)基因啟動子序列的克隆及其基礎上建立的的轉基因青鳉魚在特異性地指示雌激素類物質暴露下的魚類雌性同體發生中的應用。?

背景技術

環境雌激素類物質如一些天然的和人工合成的雌激素，部分殺蟲劑，除草劑等已經被證明能夠在低濃度下造成魚類性腺發育遲緩，精巢退化以及雌雄同體現象的發生(Gimeno?et?al.Aquat?Toxicol?43：93-109.；Papoulias?et?al.Environ?Health?Perspect?111：29-32.；Kidd?et?al.Proc?Natl?Acad?Sci?U.S.A.104：8897-8901.)。尤其是魚類雌雄同體現象能夠在各種淡水和海洋生態系統中觀測到，已經成為指示野生魚類雌性化的一個明確指標(Jobling?et?al.Environ?Sci?Technol?32：2498-2506.；Hinck?et?al.Aquat?Toxicol?95：60-70.)。如在英國部分河流和湖泊中的歐鯉種群雌雄同體發生率甚至能夠達到100％(Jobling?et?al.1998)。雄魚中嚴重雌雄同體現象能夠通過影響精子質量，受精率和孵化率等方式降低魚類的繁殖能力，進而進一步影響到魚類的種群平衡(Jobling?et?al.Biol?Reprod?67：515-524.；Williams?et?al.Environ?Toxicol?Chem?28：220-230.；An?et?al.Environ.Sci.Technol.2009，43(20)，7895-901.)。因此，評估魚類雌雄同體發生的合適方法不僅對理解雌雄同體的發生機理以及雌雄同體發生的生態毒理學效應有著非常重要的意義而且還可以應用于化學品的環境管理。?

目前，評估魚類雌雄同體的發生主要是依靠組織切片觀察的方法，但是這種方法耗時耗力，需要嫻熟的技術，花費十分昂貴，而且往往只能觀察到性腺的幾個側面，做不到準確全面的評價整個性腺的雌雄同體發生情況(Lin?et?al.Ecotox?Environ?Safe?72：286-292.)。這大大限制了對人們對魚類雌雄同體發生的理解。目前國際上并沒有靈敏，簡便，準確的實驗方法用來監測魚類的雌雄同體。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種青鳉魚卵巢結構蛋白(OSP1)基因啟動子，并在此基礎上構建起OSP1P-GFP轉基因青鳉魚，用來特異性指示魚類雌雄同體發生的發生率和發生程度。?

本發明所提供的雌激素誘導的魚卵巢結構蛋白基因啟動子，來源于模式物種青鳉魚(Oryzias?latipes)，具有序列表SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列。?

序列表中的SEQ?ID?No：1由2064個堿基組成。?

含有本發明啟動子的表達載體和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。?

本發明通過PCR技術克隆出OSP1基因啟動子，序列如SEQ?ID?No：1所示。將此啟動子連接到PEGFP-1質粒中的綠色熒光蛋白基因上游區域，用顯微注射的方式將融合質粒注射到青鳉魚受精卵中，構建出轉基因青鳉魚。?

本發明構建的轉基因魚能準確，快速，靈敏地指示外源性內分泌干擾物質暴露下造成的青鳉魚雌雄同體的發生率和發生程度，能夠應用于雌激素效應物質的快速篩選和環境中雌激素效應物質的檢測。?

下面通過實施例，結合附圖對本發明做進一步詳細描述，但不以任何方式限制本發明的范圍。?

附圖說明

圖1.以OSP1基因啟動子為基礎構建的轉基因青鳉魚雌魚中綠色熒光蛋白表達的觀察。?

A：活體觀察綠色熒光蛋白在青鳉魚卵巢中的表達；B：通過冰凍魚體，攝取性腺觀察綠色熒光蛋白在青鳉魚卵巢中的表達。?

圖2.雌雄同體雄魚性腺中綠色熒光蛋白表達的觀察。?