[發(fā)明專利]一組合成抗菌蛋白及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210303670.1
• 申請(qǐng)日: 2012-08-23
• 公開（公告）號(hào): CN102816245A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭鎧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 郭鎧
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/63;A61K38/16;A61P31/04;A61P31/10;C12R1/19;C12R1/125
• 代理公司: 北京聯(lián)創(chuàng)佳為專利事務(wù)所(普通合伙) 11362
• 代理人: 王娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一組合成抗菌蛋白、其制備方法及在制備治療細(xì)菌、真菌感染的藥物中的應(yīng)用，該抗菌蛋白對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌有顯著而特異的殺菌活性。

背景技術(shù)

抗菌蛋白的功能亞基即抗菌肽，是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60個(gè)氨基酸組成，分子量在2000-7000D左右。隨著醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，抗菌肽的研究越來越成為生物技術(shù)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的熱門課題。至今為止，在許多動(dòng)物(尤其是昆蟲)、植物、微生物和人體上已發(fā)現(xiàn)了超過200多種抗菌肽，這類短肽不僅對(duì)細(xì)菌、真菌有廣譜的殺菌作用，而且對(duì)病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有攻擊作用。臨床試驗(yàn)也表明，在機(jī)體感染病菌或可能導(dǎo)致病菌感染的情況下，抗菌肽能快速殺滅已侵入的病菌，并且能阻止病菌的繼續(xù)侵染。但是抗菌肽在快速殺滅致病菌的同時(shí)，也會(huì)對(duì)人體有益菌群造成傷害。

抗體是一種高度特異的分泌型免疫蛋白，通過其可變區(qū)域內(nèi)CDR可迅速而準(zhǔn)確地與抗原結(jié)合，引發(fā)后續(xù)免疫反應(yīng)。研究表明，即使抗體整體結(jié)構(gòu)不完整，在保持其CDR序列完好且構(gòu)象正常的情況下，仍能夠有效識(shí)別抗原。

蛋白質(zhì)重組融合技術(shù)可將兩個(gè)蛋白質(zhì)或肽鏈通過小的氨基酸片段進(jìn)行連接，同時(shí)保證兩端的結(jié)構(gòu)和功能不發(fā)生明顯改變，此技術(shù)不僅可以通過化學(xué)合成實(shí)現(xiàn)，亦可通過基因工程將待連接蛋白和連接片段DNA序列進(jìn)行共轉(zhuǎn)化并在細(xì)胞中表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于：提供一組合成抗菌蛋白及其制備方法和應(yīng)用，通過蛋白質(zhì)融合技術(shù)以及基因操作合成，制備的抗菌蛋白可通過質(zhì)譜或SDS-PAGE鑒定。利用96孔板法檢測(cè)合成蛋白的殺菌活性(In?Yup?Park?etc：FEBS?Letters：437(1998)258-262)，以預(yù)先合成的天然抗菌蛋白buforin?II、cecropin?A1為對(duì)照，進(jìn)行殺菌活性檢測(cè)。結(jié)果表明本發(fā)明合成抗菌蛋白的殺菌活性強(qiáng)于所述兩種天然抗菌蛋白的殺菌活性。利用連續(xù)培養(yǎng)法檢測(cè)合成蛋白的殺菌速率，以預(yù)先合成的天然抗菌蛋白buforin?II、cecropin?A1為對(duì)照，結(jié)果表明本發(fā)明合成抗菌蛋白生效時(shí)間比所述兩種天然抗菌蛋白更迅速。同時(shí)，使用上述兩種實(shí)驗(yàn)方法還證明具有多個(gè)識(shí)別亞基或功能亞基的復(fù)合抗菌蛋白在識(shí)別特異性和殺菌反應(yīng)速度上均優(yōu)于天然抗菌蛋白。

本發(fā)明是這樣構(gòu)成的：一組合成抗菌蛋白，所述抗菌蛋白由一個(gè)功能亞基通過連接肽與識(shí)別亞基相接合；所述識(shí)別亞基具有類似抗體的結(jié)構(gòu)，由輕鏈、即L鏈和重鏈、即H鏈通過二硫鍵接合構(gòu)成。

前述的合成抗菌蛋白中，所述功能亞基羧基端與連接肽氨基端連接，連接肽羧基端與識(shí)別亞基氨基端連接。

前述合成抗菌蛋白的結(jié)構(gòu)包含下述氨基酸序列：

功能亞基：見序列表中序列1；

連接肽：見序列表中序列2；

H鏈：序列3A?序列4B?序列5C?序列6；

L鏈：序列7X?序列8Y?序列9Z?序列10；

所述A為序列11時(shí)，B、C、X、Y、Z分別為序列12、序列13、序列14、序列15、序列16；A為序列17時(shí)，B、C、X、Y、Z分別為序列18、序列19、序列20、序列21、序列22；A為序列23時(shí)，B、C、X、Y、Z分別為序列24、序列25、序列26、序列27、序列28。

前述的合成抗菌蛋白中，所述連接肽的序列優(yōu)選為Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser或Gly-Gly-Ala-Ser。

前述的合成抗菌蛋白中，所述H鏈26～35、50～65、96～102位及L鏈24～34、49～56、89～97位為CDR序列，用于特異性識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞；H鏈22位半胱氨酸與L鏈23位半胱氨酸形成的二硫鍵將兩條肽鏈連接成為識(shí)別亞基。

本發(fā)明所述的合成抗菌蛋白還包括在所述抗菌蛋白中增加1-2個(gè)識(shí)別亞基或功能亞基并通過連接肽連接于原有蛋白而得到的功能等同物蛋白。

本發(fā)明提供的合成抗菌蛋白的制備方法為：將編碼所述抗菌蛋白的基因克隆到載體上，然后進(jìn)入宿主細(xì)胞中表達(dá)后獲得所述抗菌蛋白。制得的抗菌蛋白可通過質(zhì)譜或SDS-PAGE鑒定。

前述方法中，所述的載體是質(zhì)?；虿《局械囊环N；所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明所提供的合成抗菌蛋白在制備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或真菌感染的藥物中的應(yīng)用。