[發(fā)明專利]一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體及構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210302034.7
• 申請日: 2012-08-23
• 公開（公告）號: CN102816794A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張松;梁瑞芳;劉暢;尹芝南
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/11
• 代理公司: 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

IL-27（Interleukin-27），是近些年發(fā)現(xiàn)的新的白細(xì)胞介素，該細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中對于炎癥及腫瘤有廣泛而重要的作用。IL-27重組蛋白在此領(lǐng)域的研究中具有重要意義。然而由于IL-27由EBI3和p28亞基共同組成一個異源二聚體，使得該蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建相對困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決IL-27重組蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建問題，提供一種高效表達(dá)IL-27的真核表達(dá)載體，以及方法簡單、操作方便的構(gòu)建方法。

本發(fā)明首先提供了一種鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體pSZ12，以及用于構(gòu)建該載體的相關(guān)引物：引物PRM-149如序列表SEQ?ID?No.1，PRM-150如序列表SEQ?ID?No.2，PRM-151如序列表SEQ?ID?No.3，PRM-152如序列表SEQ?ID?No.4。

本發(fā)明的關(guān)鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ?ID?No.7所示，其對應(yīng)的氨基酸序列為：EBI3(met1-pro228)-(GGGS)₄-p28(phe29-ser234)-6×His-stop?condon.

本發(fā)明同時提供了EBI3和p28的連接鏈(GGGS)₄的編碼DNA序列，如序列表SEQ?IDNo.9所示。

本發(fā)明將pcDNA3.1+作為基礎(chǔ)載體實現(xiàn)了高效的蛋白表達(dá)效率。

本發(fā)明所述鼠源IL-27重組蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括下列步驟：

第1、設(shè)計引物

引物PRM-149如序列表SEQ?ID?No.1所示，包含了KpnI酶切位點和EBI3的5’端編碼序列的一部分；

引物PMR-150如序列表SEQ?ID?No.2所示，包含了(GGGS)₄鏈編碼序列、EBI3的3’端編碼序列的一部分和p28的5’端編碼序列的一部分；

引物PMR-151如序列表SEQ?ID?No.3所示，包含了p28的5’端編碼序列的一部分；

引物PMR-152如序列表SEQ?ID?No.4所示，包含了p28的3’端編碼序列的一部分、6×組氨酸編碼序列，終止密碼子以及XhoI酶切位點；

第2、擴增關(guān)鍵片段pSZ12-insert

首先提取IFN-γ+CpG刺激的小鼠樹突狀細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)成cDNA，以此為模板，以引物PRM-149和PRM-150擴增出片段pSZ12-L，如序列表SEQ?ID?No.5所示，以引物PRM-151和PRM-152擴增出片段pSZ12-R，如序列表SEQ?ID?No.6所示；

然后以純化后的pSZ12-L和pSZ12-R為模板，以PRM-149和PRM-152為引物做SOEPCR，擴增出關(guān)鍵片段pSZ12-insert，如序列表SEQ?ID?No.7所示（附圖1）；

第3、將pSZ12-insert和pcDNA3.1+載體用KpnI+XhoI雙酶切并純化后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐抗性LB培養(yǎng)基平板；

第4、鑒定質(zhì)粒pSZ12，如序列表SEQ?ID?No.8所示；

挑取單克隆，氨芐抗性液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)并提質(zhì)粒。

酶切鑒定（附圖2），并測序鑒定，與預(yù)期設(shè)計完全一致。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果：

本發(fā)明中的關(guān)鍵片段pSZ12-insert可克隆至其他載體上，以方便不同情況下的IL-27重組蛋白的表達(dá)應(yīng)用。

本發(fā)明提供了自主設(shè)計的(GGGS)₄連接兩個亞基，可以保證兩個亞基的同時表達(dá)并形成類似內(nèi)源性蛋白的結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明中pcDNA3.1+所包含的neo抗性基因序列可以方便構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。neo抗性基因序列使成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞具有對一定濃度G418的抗性，利用這一特點可以通過向培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的G418來篩選出成功轉(zhuǎn)染該表達(dá)載體的細(xì)胞并進行培養(yǎng)，從而構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。

本發(fā)明中所包含的6×組氨酸編碼序列可以方便IL-27重組蛋白的純化。現(xiàn)在市場上已經(jīng)有成熟的篩選帶有6×組氨酸標(biāo)簽的蛋白的純化柱，可以很方便的將表達(dá)出的IL-27重組蛋白收集純化，且不影響IL-27重組蛋白的生物學(xué)活性。